Ферментный термистор

Благодаря своей высокой специфичности ферменты давно применяются в области аналитической химии. Применение иммобилизованных ферментов способствует созданию методов без-реагентного анализа, позволяющих проводить практически непрерывный анализ водных растворов органических (а в ряде случаев и неорганических) соединений. В свою очередь достижения в этой области стимулируют развитие эффективных методов контроля окружающей среды, клинической диагностики и т. д. Созданные в недавнее время так называемые ферментные электроды применяются в быстром автоматическом анализе многокомпонентных систем. Наконец, разработаны чувствительные ферментативные методы с использованием термисторов, в том числе, и с ферментными термисторами . [c.16]

Рис. 29.2. Ферментный термистор с ручным управление. .

Ферментные термисторы и аналогичные им устройства успешно используют во многих областях биоанализа, например в клиническом анализе, контроле технологических, в том числе ферментационных процессов, контроле загрязнения окружающей среды. Недавно показана возможность их применения при хроматографическом определении ферментов в сложных смесях. Кроме того, на основе ферментного термистора разработана проточная система для иммуноанализа. В табл. 29.2 охарактеризовано большое число анализов, выполненных с помощью ферментных калориметров. Правда, следует иметь в виду, что некоторые из цитируемых здесь работ [c.462]

Таблица 29.2. Определение веществ при помощи ферментных термисторов

При незначительной модификации проточной системы ферментный термистор можно использовать для определения активности растворенного фермента. Исследуемый раствор фермента и раствор соответствующего субстрата (в относительном избытке) пропускают порознь через теплообменник затем их смешивают, быстро пропускают через один из коротких внутренних теплообменников для устранения тепла, выделяемого при смешении растворов, и направляют в реакционную камеру (объемом 1 мл). Последняя устанавливается вместо обычной ферментной колонки и представляет собой либо неактивную колонку, либо тефлоновую трубку, образующую реакционную спираль . Температуру на выходе реакционной камеры непрерывно измеряют одним из термисторных датчиков, как описано в разделе 29.2. Для большого числа разных ферментов обнаружена линейная корреляция между температурным откликом и активностью фермента [6]. Чувствительность метода-0,01-0,1 ед. активности/мл в зависимости от типа фермента. Калориметрическое определение активности растворенных ферментов может представить интерес для клинического анализа, а также для контроля процессов очистки ферментов. Хотя абсолютная чувствительность этого метода невелика, он имеет свои достоинства, так как позволяет проводить прямые непрерывные измерения в потоке. Его можно применять для анализа неочищенных проб, расходуя недорогие субстраты (здесь нет необходимости в дорогостоящих субстратах, дающих окрашенные продукты). [c.467]

В аналитических исследованиях в связи с иммобилизованными ферментами необходимо упомянуть ферментные электроды [21], ферментные термисторы [40] и ферменты, ковалентно связанные с полистиролом или найлоном для целей автоматического анализа [24, 46]. Гильбо [22], например, использовал ферментные электроды для определения глюкозы, мочевины, L-аминокислот, галактозы, ацетилхолина и дегидрогеназ. Ферхмеиты, связанные с капиллярными реакторами, использованы в соединении с автоанализатором фирмы Te hni on для анализа различных субстратов, таких как глюкоза, мочевина и мочевая кислота [55]. Гудзон и др. [20] описали применение иммобилизованной холинэстеразы для контроля воздуха и воды, для обнаружения ингибиторов фермента, таких, как пестициды. Система характеризуется чрезвычайной чувствительностью. Например, органофосфат параоксон может быть обнаружен в количествах 1 10 в воздухе и воде. [c.442]

Недавно Хер бстен и другие с помощью сенсора для оценки продуцирования водорода [15] исследовали устойчивость к ампициллину штамма Е. соН, вызывающего заражение мочевых путей [14] параллельно определяли три других параметра системы, в том числе выделение тепла с помощью ферментного термистора [16] (см. также гл. 29), внутриклеточную концентрацию АТР и образование кислот и оснований. [c.432]

Существенно большая эффективность определения теплоты реакции достигнута в системах, в которых использовали небольшие колонки с ферментом, иммобилизованным на частицах носителя. К таким системам относятся ферментный термистор [30, 32] и проточный энтальпиметрический анализатор с иммобилизованным ферментом [3]. Описана также комбинация серийного энтальпиметра с термостатируемой колонкой, содержащей иммобилизованный фермент [20]. В этих системах тепло переносится жидкостью, проходящей через колонку мимо термодатчика, вмонтированного в верхнюю часть колонки или на ее выходе. [c.458]

В работе [7] был впервые описан разработанный авторами ферментный термистор. Схема последнего варианта этого прибора приведена на рис. 29.1. На рис. 29.2 показано все необходимое для ферментного термоанализа оборудование. В алюминиевом цилиндре с контролируемой температурой (25 30 или 37 "С), помещенном в изолирующую рубашку из полиуретана, находится другой алюминиевый цилиндр, отделенный от первого тонкой прослойкой воздуха, до некоторой степени обеспечивающей термическую изоляцию. Тепло передается между двумя блоками в основном путем конвекции жидкости, перекачиваемой из главного теплообменника во внешнем цилиндре в короткий вспомогательный теплообменник во внутреннем цилиндре. Таким образом, колонки окружены средой с в высокой степени постоянной температурой. [c.458]

Если первая реакция слабо экзотермична, соответствующий ей фермент можно помещать в предколонку, находящуюся снаружи ферментного термистора, оставив внутри калориметра только фермент(ы), катализирующие последующие реакции. Это позволяет увеличить гибкость системы и повышает ее суммарную производительность, поскольку можно использовать более эффективные колонки с ферментами, особенно на первой стадии. Таким способом с помощью 3-глюкозооксидазы определяли цел-лобиозу [12], а с помощью (3-галактозидазы-лактозу [24]. Поскольку энтальпия гидролиза очень мала, для термических измерений использовали образующуюся при гидролизе глюкозу, окисляя последнюю в ферментном термисторе с глюкозооксида-за/каталазной колонкой. [c.462]

Вместо гексокиназы удобнее использовать глюкозооксидазу, так как последняя более стабильна и не нуждается в кофакторе [8]. Недостатком данной системы является, однако, то, что отклик линеен лишь до 0,45 ммоль/л, а при соиммобилизации глюкозооксидазы и каталазы-до 0,7 ммоль/л. Этот недостаток можно преодолеть, разбавляя пробы в 50-100 раз или вводя малые объемы сыворотки (5-20 мкл) прямо в поток буферного раствора, входящий в ферментный термистор. В результате дости- [c.464]

В настоящее время стала вполне доступной оксидаза из Pedi o us pseudomonas (ЕС. 1.1.3.2). Использование ее в описанных выше системах с рециклированием [40] позволяет достичь чрезвычайно высокой чувствительности (10 нМ). Разумеется, этот фермент можно использовать в ферментном термисторе, лучше в сочетании с каталазой, как в системе тлюкозооксидаза/каталаза. [c.466]

Быстрое ферментативное определение этанола представляет интерес как для клинической химии, так и для биотехнологии. В одной из недавних работ [18] сравнивали результаты определения спирта ферментным электродом на основе полярографического кислородного электрода и ферментным термистором в обоих случаях использовали один и тот же фермент - алкогольоксидазу из andida boidini (ЕС 1.1.3.13). Стабильность алкогольоксидазы на пористом стекле в ферментном термисторе за- [c.466]

Ферментный термистор успешно применяют в качестве инструмента специфического контроля в гель-фильтрации, ионообменной и аффинной хроматографии [11]. Поскольку ферментный термистор можно использовать для непрерывного определения активности ферментов непосредственно в неочищенных пробах, с его помощью можно идентифицировать и локализовать отдельные компоненты сложной хроматограммы, например на начальных стадиях процесса очистки фермента (рис. 29.4). Кроме того, в аффинной хроматографии при элюировании ферментам часто сопутствуют их коферменты, сильно поглощающие в УФ-области, что затрудняет непрерывный контроль за содержанием фермента по УФ-спектрам или спектрофотометрически регистрируемым изменениям концентрации NAD(P)H. Таким образом, в аффинной хроматографии калориметрическое определение активности элюированного фермента имеет определенные преимущества. [c.467]

Как уже упоминалось, для ряда сахаров разработаны методы непрерывного определения в потоке. Авторы исследовали несколько вариантов контроля технологических процессов, в которых участвуют такие сахара [21, 28]. Оказалось, что ферментный термистор работает достаточно стабильно и может непрерывно использоваться в течение нескольких дней без смены ферментной колонки или переградуировки. Рекомендуется только один раз в день проверять базовую линию системы. При наличии аналогового контроллера и компьютера система довольно быстро (за 1-3 мин) реагирует на внезапные изменения концентрации сахара. Тот же подход можно в принципе использовать для контроля глюкозы в крови пациента при этом доза инсулина определяется сигналом ферментного термистора, непрерывно измеряющего уровень глюкозы в крови. [c.469]

В работе [27] пенициллин, присутствующий в бродильном бульоне, определяли с помощью системы с иммобилизованной пенициллиназой ((3-лактамазой). При иммобилизации фермента на пористом стекле диапазон определяемых концентраций охватывал по меньшей мере от 0,01 до 100 ммоль/л. В качестве носителя фермента опробовали также найлоновую трубку. На рис. 29.6 результаты определения пенициллина G в пробах бродильного бульона нанесены на градуировочную кривую для области низких концентраций. Коэффициент корреляции результатов, полученных калориметрическим и стандартным методом, составляет 0,997. Определение пенициллина ферментным термистором в производстве антибиотиков имеет явное преимущество по сравнению с обычно используемыми методами, такими как высокоэффективная жидкостная хроматография и фотометрия. Несколько примеров успешного применения калориметрических методов вместо обычных приведено в работе [13]. [c.469]

М буферном растворе фосфата натрия, pH 7,0 (9) и данные для проб, содержащих известные количества пенициллина в разбавленном в 10 раз бродильном бульоне (О). Объем пробы 1мл, скорость потока 1 мл/мин. Колонка ферментного термистора содержала пенициллиназу, иммобилизованную на пористом стекле. [c.469]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология