Кинетика быстрых ферментативных

Исследования кинетики ферментативных реакций в стационарном режиме — один из наиболее распространенных способов изучения механизма действия ферментов. Это определяется рядом особенностей ферментативных реакций и прежде всего тем, что для ферментативных реакций стационарное состояние устанавливается весьма быстро. Для простейшей схемы ферментативного процесса с участием одного промежуточного соединения (схема Михаэлиса — Ментен) [c.171]

Биохимия изучает метаболизм лекарственных веществ, привлекая методы клинической биохимии анализ лекарств и их метаболитов в биологических материалах, измерение активности и кинетики ферментов и т. д. Нужно отметить, что метаболизм лекарств зависит не только от таких факторов, как генетические, возрастные, органоспецифические, нейроэндокринные особенности организма, но и от способа введения лекарства в организм и от состояния внещней среды. Например, способ введения лекарства в организм определяет путь его метаболизма. Энтеральный способ введения лекарства обеспечивает его быстрый ферментативный гидролиз в желудочно-кишечном тракте, продукты которого при всасывании с кровью воротной вены сразу поступают в печень. Нужно отметить, что печень — это самый главный орган переработки неродственных организму [c.506]

С другой стороны изучение ферментативных реакций в стационарном режиме имеет ряд существенных недостатков. Наиболее важным из них является то, что стационарная кинетика дает весьма ограниченную информацию о детальном кинетическом механизме ферментативной реакции. Стационарная кинетика, отражая лишь лимитирующие стадии процесса, практически не дает информации о быстрых , нелимитирующих стадиях превращения субстрата в активном центре фермента. Определение элементарных констант скорости многостадийной ферментативной реакции из данных стационарной кинетики не представ-ляется.возможным. Действительно, кинетика каталитической реакции, включающей п промежуточных соединений (схема 5.16), описывается 2 п + 1) константами скорости. Стационарная же скорость этой обратимой реакции независимо от числа промежуточных соединений, принимающих участие в механизме реакции, дается уравнением (см. гл. VI) [c.174]

Флуоресцентный метод применяют для изучения быстрых реакций возбужденных молекул, кислотно-основных реакций возбужденных молекул и комплексообразования в возбужденном электронном состоянии, определения концентрации люминесцирующих веществ в смеси, изучения кинетики и механизма ферментативных реакций, изучения межмолекулярного переноса энергии. [c.74]

Такой механизм согласуется с результатами исследования быстрой (предстационарной) кинетики ферментативного процесса [13, 24, 29]. [c.157]

Превращение субстрата под действием фермента проходит обычно через ряд короткоживущих промежуточных соединений, изучение реакционной способности которых помогает выяснить механизм ферментативного катализа. К настоящему времени рав работаны такие методы, которые позволяют определять значения констант скоростей промежуточных стадий ферментативных реакций при изучении кинетики их протекания в стационарном режиме (см. гл. 7). Однако наиболее прямую и надежную информацию о кинетике промежуточных стадий можно получить, изучая ферментативные реакции в нестационарном режиме их протекания (с применением методов изучения быстрых реакций в растворах). [c.186]

Для простоты обсуждения механизмов целесообразно введение системы их классификации. В работе Варфоломеева, Наки, Ярополова, Побочина (1981) для описания механизмов сложных химических и ферментативных реакций предложена и использована система, основанная на записи последовательности различных стадий процесса. Важно то обстоятельство, что в стационарном состоянии в уравнение скорости реакции входят лишь параметры лимитирующих стадий и стадий, предшествующих скоростьопределяющей. Быстрые, нелимитирующие стадии процесса, следующие за наиболее медленной, не оказывают влияния на скорость реакции и не проявляются в кинетике процесса. [c.152]

Релаксационные методы, используемые для исследования быстрых химических реакций в растворе, имеют весьма высокую разрешающую способность. Так, например, метод поглощения ультразвука обнаруживает время разрешения вплоть до наносекундного диапазона [42]. Именно поэтому релаксационная кинетика широко используется при исследовании механизмов ферментативных реакций. [c.214]

Определение абсолютной концентрации активных центров фермента из кинетических данных. В предыдущих разделах была рассмотрена кинетика ферментативных реакций в условиях избытка субстрата по сравнению с ферментом ([S]q [Elg). Рассмотрим теперь случай, когда концентрация субстрата сравнима по величине с концентрацией. фермента ([Slg [Е] ), и выведем уравнение для скорости ферментативной реакции, протекающей по двухстадийному мез анизму при условии быстрого установления равновесия на стадии образования фермент-субстратного комплекса [c.232]

Образование продукта Pi в начальный период реакции следует кинетике первого порядка это означает, что равновесие при образовании фермент-субстратного комплекса (ES) устанавливается очень быстро, в пределах мертвого времени прибора, Таким образом, в изучаемом временном интервале ферментативного процесса действительно соотношение [c.204]

Релаксационная кинетика. При быстром возмущающем воздействии на систему (изменение т-ры, давления, электрич. поля) время, к-рое необходимо системе для достижения нового равновесия или стационарного состояния, зависит от скорости процессов, определяющих каталитич. ферментативный цикл. [c.82]

Основное направление научных работ — исследование сверхбыстрых химических реакций разработанными им методами химической релаксационной спектрометрии. С помощью метода температурного скачка исследовал кинетику реакций ионов водорода и гидроксила с кислотно-основными индикаторами в водном растворе. Для изучения быстрых реакций в растворах слабых электролитов предложил метод наложения сильного электрического поля, увеличивающего степень диссоциации электролита. Благодаря применению созданных им методов, использующих периодическое возмущение системы, получены данные об образовании ионных пар и десольватации ионов в водных растворах электролитов, о реакциях переноса протона, о кинетике ассоциации карбоновых кислот в результате образования водородных связей и др. Изучал ферментативный катализ, механизм передачи информации и другие вопросы молекулярной биологии. [c.589]

Механизм действия сериновых протеиназ в настоящее время понят лучше механизма любого другого типа ферментов и может служить иллюстрацией некоторых важных моментов, касающихся ферментативного катализа. Гидролиз амида может показаться не слишком сложной реакцией химику-органику. В случае же ферментативного катализа для обеспечения успешного протекания реакции необходимо очень строгое обеспечение тех стадий, которые химик может счастливо игнорировать. В противном случае будет происходить замедление реакции. Даже механизм, приведенный на схемах (28) — (34) и насчитывающий 9 отдельных стадий, является, безусловно, упрощенным. [В качестве иллюстрации можно отметить, что в последних исследованиях механизма действия химотрипсина с использованием методов быстрой кинетики в водном диметилсульфоксиде при —90°С показано наличие четырех процессов, предшествующих образованию тетраэдрического интермедиата см. схему (28) . Первым из этих процессов является связывание субстрата, остальные, по-видимому, представляют собой индуцированные субстратом конформационные изменения в ферменте, необходимые для обеспечения правильной стереохимии катализа] [63]. Нетрудно понять, почему для катализа распада такой высоко энергетической частицы, как тетраэдрический интермедиат, требуется особое обеспечение такие стадии могут в конце концов быть скоростьопределяющими в самых простых реакциях. Однако в связи с тем, что для эффективного протекания ферментативного катализа необходимы очень [c.497]

Элементарная модель для рассмотрения кинетики редупликации ДНК — одно.мерная матрица, на которой сорбируются НТФ, причем с одного конца идет практически необратимая их поли-конденсация. Грубые оценки показывают, что диффузия НТФ из раствора к матрице протекает быстрее процессов на матрице и скорость синтеза лимитируется ферментативным процессом. В согласии с опытом расчет показывает, что синтез должен идти без индукционного периода. [c.251]

Первое систематическое изучение кинетики реакций с участием одного субстрата по схеме 1 провели Михаэлис и Ментен [10], однако рассмотрение кинетики ферментативных реакций по методу стационарных состояний, развитое Бриггсом и Холдейном 11], является более гибким и лучше согласуется с трактовкой нестабильных реакционноспособных промежуточных веществ в других типах реакций. Согласно этой трактовке, концентрация промежуточного комплекса быстро достигает стационарной величины. Выражения для скоростей реакций также упрощаются при допущении, что концентрация фермента намного меньше, чем концентрация субстрата, что несомненно справедливо для всех практически важных случаев. [c.116]

Кинетика ферментативных реакций. Кинетика ферментативных реакций изучает скорость биохимических реакций, которые протекают в присутствии катализаторов— ферментов. Живые клетки способны проводить очень быстро сложные реакции при температуре 37° и ниже. Такие реакции без ферментов шли бы очень медленно. [c.75]

Вторым направлением развития метода потенциометрического титрования является создание способа поддержания в ходе ферментативной реакции постоянства концентрации субстрата в реакционной среде. Необходимость такого метода диктуется особенностями кинетики реакций, катализируемых ацетилхолинэстеразой и некоторыми другими ферментами, активность которых тормозится уже при сравнительно низких концентрациях субстрата. Прн изучении кинетики таких реакций во избежание субстратного торможения приходится работать в области концентраций, не достигающих насыщения фермента. С другой стороны, при высокой молекулярной активности фермента (как, например, в случае ацетилхолинэстеразы) это приводит к быстрому снижению концентрации субстрата и переходу из кинетической области нулевого порядка к мономолекулярной, что затрудняет вычисление начальной скорости реакции. [c.152]

Начальная скорость ферментативной реакции будет прямо пропорциональна концентрации присутствующего фермента. Любое наблюдаемое отклонение от линейной зависимости вовсе не означает изменения того очевидного принципа, что две молекулы фермента вызовут превращение в результате реакции в два раза большего (по сравнению с одной молекулой) количества вещества. Отсутствие линейной зависимости между скоростью реакции и концентрацией фермента свидетельствует о влиянии какого-то фактора, усложняющего ход реакции. Такими факторами — если мы не имеем дело со слишком быстро протекающей реакцией, в связи с чем данный метод оказывается непригодным для изучения ее кинетики, — могут быть присутствие в реакционной среде ингибитора или феномен подавления реакции ее продуктом. Обычно такое кажущееся отклонение обусловлено тем, что с помощью данного метода определения активности фермента мы на самом деле измеряем не истинную начальную скорость реакции, а лишь скорость на ранних этапах реакции. Таким образом, обнаружение нелинейной зависимости между скоростью реакции и концентрацией фермента должно прежде всего заставить исследователя критически проанализировать детали используемого метода, прежде чем пытаться строить предположения о новых принципах кинетики данной реакции. [c.104]

Уонг [11] недавно также рассмотрел вопросы, связанные с математическим описанием кинетики ферментативных реакций, обратив особое внимание на гипотезу стационарности. Он отмечает, что существенным условием применимости гипотезы стационарности является быстрое образование фермент-субстратного комплекса — условие, которое, несомненно, выполняется при достаточно большом избытке субстрата по отношению к ферменту. Практический вывод, к которому он приходит (распространяя его и на двухсубстратные реакции), состоит в том, что принцип стационарности может быть использован в условиях, обеспечивающих линейную зависимость U0 от Ео. [c.53]

Разработан также ряд быстрорегистрирующих спектрофото-метрических установок. Данные приборы используют два основных принципа комбинацию спектрофотометра с кюветой остановлен ной струи и комбинацию спектрофотометра с устройством для температурного скачка. На этих приборах в основном изучается кинетика быстрых ферментативных реакций, быстрых конформацион-ных переходов в биологических молекулах, температурных зависимостей многих процессов жизнедеятельности клетки и т. п. [c.16]

Хотя струйные методы позволяют проводить измерения при длительности реакции порядка миллисекунд, а не секунд, все же значительное число важных реакций не удается непосредственно исследовать этим методом и они нуждаются в еще более быстрой технике измерения. Даже медленные лимитирующие реакции в области максимальных скоростей процесса оказываются слишком быстрыми для измерений струйными методами. Помимо того, хотя скорость бимолекулярных стадий можно регулировать путем изменения концентрации, некоторые реакции, например ионные, вообще не поддаются прямому измерению с помощью струйных методов. Для того чтобы заполнить этот пробел в химической кинетике быстрых реакций, Эйген и его сотрудники разработали релаксационные методы, с помощью которых можно проводить кинетические измерения в промежутки времени порядка микросекунд. Эти мощные методы позволяют изучать бимолекулярные реакции, характеризующиеся константой скорости 10 М с . Они нашли применение и в исследовании многих ферментативных реакций (главным образом, в работах Хаммеса и сотрудников [12—17]). [c.185]

В настоящее время метод остановленной струи широко приме-ляется для решения многих задач химической кинетики установление механизмов химической реакции, определение стадий, лимитирующих протекание реакции обнаружение промежуточных комплексов, определение кинетики ферментативных реакций, установление числа и концентрации активных центров фермента, изучение быстрых конформационны5( переходов в белках и нуклеиновых кислотах. Метод требует быстрой регистрации это единственное существенное ограничение его применимости. Особое внимание при применении метода остановленной струи необходимо уделять тер-мостатированию, так как разница в температурах в кювете наблюдения и растворе смеси реагентов может привести к большим оптическим ошибкам, затрудняющим установление механизма наблюдаемой реакции. Точность определения констант скоростей данным методом примерно такая, как и при обычных спектрофотометрических измерениях кинетики химических реакций. [c.28]

Другой важный результат был получен методами нестационарной кинетики — это константы скоростей весьма быстрой бимолекулярной стадии образования промежуточного фермент-субстратного комплекса (табл. 34). Можно было бк думать, согласно (7.2), что эти значения гораздо больше величины, которую дает оценка их нижнего предела. Однако из табл. 34 видно, что наиболее распространенные значения кх = 10 — 10 М" -с и, следовательно, они того же порядка, что и величины Кт.каж, опрбделяющие общую скорость ферментативной реакции (см. табл. 33). [c.269]

Кинетика ферментативных реакций в предстационарном режиме их протекания изучается в основном методами остановленной струи . Принципиальная особенность этих методов состоит в быстром смешивании растворов реагирующих веществ в смесительной камере специальной конструкции [3, 4], после чего смесь поступает в измерительную кювету. Чаще всего в установках типа остановленной струи используется спектрофотометрический метод измерения с осциллографичеокой регистрацией сигнала от фотоумножителя. Мертвое время лучших современных установок подобного типа составляет 0,1 —0,3 мсек. [c.188]

В последнее время работами Хесса с сотрудниками [5—7] на примере а-химотрипсина был развит новый метод изучения кинетики начальных стадий ферментативных реакций, получивший название метода вытеснения профлавина . Метод основан на том факте, что краситель профлавин (3,6-диаминоакридин) при связывании с а-химотрипсином в водном растворе изменяет свой спектр поглощения в ультрафиолетовой области. Величина разностного спектра поглощения, имеющего максимальное значение при длине волны 465 нм, пропорциональна -концентрации комплекса фермент-профлавин. Введение в систему фермент-профлавин субстрата, конкурирующего с красителем за связывание на активном центре а-химотрипсина, приводит к двум последовательным процессам вытеснения профлавина. Первый, очень быстрый процесс, заключается в обратимом вытеснении красителя из комплекса его с ферментом за счет образования нековалентного фермент-субстратного комплекса. Второй процесс, времена прохождения которого лежат обычно в пределах разрешения установок типа остановленной струи , вызван химическим взаимодействием субстрата с ферментом (например, образованием ацилферментного промежуточного соединения), что приводит к дополнительному уменьшению концентрации комплекса фермент-профлавин. Изучение кинетики второго процесса при различных концентрациях субстрата в дополнение к изучению кинетики ферментативной реакции в стационарном режиме позволяет сделать заключения о стадийности изучаемой реакции, а также найти значения констант скоростей промежуточных стадий ферментативной реакции. [c.188]

В полиферментных системах, примером которых является цел-люлазная (см. схему 117), установление стационарного состояния по отдельным компонентам обычно происходит в двух совершенно различных временных масштабах. Первым устанавливается стационарное состояние по фермент-субстратным комплексам (на схеме 117 не показано), когда скорости их образования и распада значительно превосходят разницу между этими скоростями (здесь и далее рассматривается кинетика при избытке субстрата по сравнению с концентрациями ферментов в системе). Как правило, данное условие начинает выполняться уже в начальный период реакции (в секундном диапазоне или еще быстрее), когда система в целом еще нестационарна по промежуточным метаболитам. Переход всей полиферментной системы в стационарное состояние, в котором концентрации промежуточных метаболитов практически не меняются во времени (точнее, когда скорости их образования и распада значительно превосходят разницу между этими скоростями), происходит обычно достаточно медленно (нередко стационарное состояние вообще не достигается), для большинства изученных целлюлолитических реакций в реальных условиях в течение нескольких часов [24—26]. Это позволяет считать при анализе предстационарной кинетики полиферментных систем, что стационарное состояние по фермент-субстратным комплексам устанавливается практически мгновенно и что образование и распад промежуточных метаболитов происходит в соответствии с обычным уравнением Михаэлиса — Ментен. Тогда в условиях превраи ения исходного субстрата на небольшую глубину, принимая гомогенное распределение ферментов и субстратов в целлюлазной системе и считая превращения практически необратимыми, кинетику ферментативного гидролиза целлюлозы (см. схему 117) описывает следующая система дифференциальных уравнений [c.125]

Весьма важным разделом Ф.х., тесно связанным с хим. кинетикой, является учение о катализе, т. е. об изменении скорости и направления хим. р-ции при воздействии в-в (катализаторов), участвующих в р-ции, но остающихся химически неизменными после каждого цикла превращений и поэтому не входящих в состав конечных продуктов. При гомогенном катализе катализатор и реагирующие в-ва находятся в одной фазе в мол.-дисперсном состоянии, товда как при гетерогенном катализе катализатор образует самостоят. фазу, отделенную границей раздела от фазы, вк-мй находятся реагирующие в-ва. Наличие границы раздела фаз в гетерогенном кягализе означает его зависимость сгг физ. состояния пов-сти катализатора и его изменений в ходе р-ции. В качестве самостоят. типа рассматривают микрогетерогенный катализ, напр, ферментативный катализ и мембранный катализ, играющие особенно важную роль в биол. процессах. Быстро развивается металлокомплексный катализ, характеризующийся весьма высокой селективностью и мягкими условиями осуществления р-ций. [c.94]

Ионно-молекулярные реакции являются основой не только химической ионизации, их роль также существенна в процессах эмиссии ионов, протекающих при бомбардировке быстрыми атомами (ББА) объектов в конденсированной фазе. Масс-спектрометрия с ББА уникальна по чувствительности и информативности, применяется в биологии и медицине для исследования кинетики реакций, в том числе ферментативных в координационной химии позволяет определять структуру и устойчивость 7с-комплексов переходных металлов, оценивать термодинамические констаигы устойчивости комплексов щелочных металлов с краун-эфирами и т.д. [c.143]

В число основных факторов, определяющих начальную скорость ферментативной реакции, входят концентрация фермента и субстрата, pH и температура, наличие активаторов и ингибиторов, причем концентрация субстрата является одним из наиболее важных. График зависимости между начальной скоростью и концентрацией субстрата выражается в виде ветви равнобочной гиперболы. Краеугольным камнем ферментативной кинетики является теория Михаэлиса-Ментен о механизме взаимодействия фермента и субстрата через образование про.межуточного фермент-субстратного комплекса, что является исходным моментом самых современных концепций. Теория исходила из факта, что равновесие между ферментом и субстратом достигается быстрее, чем разрушается фермент-субстратный комплекс. Однако анализ, проведенный Бригсом и Холдейном, показал, что в любой момент реакции скорости образования и распада фермент-субстратного комплекса практически равны, то есть достигается стационарное состояние, в котором концентрация промежуточного соединения постоянна. На основании этого было предложено уравнение, выполняемое для многих механизмов реакций, катализируемых ферментами, которое на- [c.203]

В системах с участием энзоменов протекает несколько последовательных процессов 1) междоменный обмен электронами, 2) перенос электронов на активный центр (восстановление активного центра), 3) образование продукта восстановленным активным центром фермента. Исследование кинетики выделения водорода после предварительной поляризации матрицы для образцов с различным удельным содержанием активных центров фермента показало, что лимитирует скорость процесса ферментативная стадия. Процессы междоменного обмена и переноса электронов на активные центры фермента протекают существенно быстрее. [c.84]

Очевидно, что в дополнение к регуляторным механизмам, которые можно предсказать на основании законов химической кинетики интегрированной системы, живая природа разработала специфические механизмы ферментативного контроля. Прежде чем перейти к обсуждению таких механизмов, отметим, что скорость определенной последовательности реакций будет зависеть от доступности субстратов и кофакторов соответствующих ферментов. Как мы видели, изучение процесса гликолиза началось с наблюдения, что распад глюкозы под действием дрожжевого сока быстро замедлялся и прекращался совсем, но потом возобновлялся, если в реакционную смесь добавляли ортофосфат. В другом случае гликолиз не протекал дальше образования фруктозо-1,6-дифосфата без добавления АДФ именно таким способом Гарден и Йонг впервые обнаружили АДФ. [c.53]

Браунштейн, обстоятельно описывая процесс механизма действия ферментов, указывает, что первая стадия образования лабильного оомежуточного комплекса протекает энергичнее (быстрее других стадий). Ниже мы остано-АнтиВарвЬЗРныи. ви гся на кинетике ферментативных реак-кошлекс ций. [c.16]

Тщательное исследование рН-функций оказалось весьма ценным при изучении механизма действия гидролаз. Возможность изолировать индивидуальные кинетические стадии с помощью методов остановленного потока, стационарной кинетики и релаксационной техники позволила получить вполне четкие результаты. Наиболее определенные данные при использовании некоторых субстратов были получены для трипсина и химотрипсина [2,3]. Именно с помощью такого подхода впервые было уста-йовлено участие остатков гистидина в механизме действия химотрипсина на стадиях ацилирования и деацилирования. Некоторые данные стационарной кинетики привели к полезным выводам о механизме действия негидролитических ферментов. Можно думать, что этот метод анализа механизмов ферментативных реакций будет быстро развиваться. Группа Альберти [4] провела очень тщательное измерение величин р/С и энтальпии ионизации связывающих группировок фумаразы. Данные о [c.217]

В последнее десятилетие в зиач/ительной степеии бла,годаря работам Эйгена широкое эксперимеитальное и теоретическое развитие получили быстрокинетические релаксационные методы. Релаксационные методы основаны на том, что при быстром возмущающем воздействии на систему (изменение температуры, давления, электрического поля) время, которое необходимо сиАеме для достижения нового равновесия (или стационарного состояния) зависит от скорости и механизмов химических реакций (или иногда от скорости диффузии реагентов). Рассмотрим принципы релаксационной кинетики на примере обратимой ферментативной реакции с участием произвольного, числа п промежуточных соединений (Eigen, Hammes, 1963) [c.210]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология