Непрерывные методы определения активности ферментов

Метод иммуноферментного анализа занял прочное место среди методов биохимического микроанализа. Однако следует иметь в виду, что его возможности еще до сих пор остаются неисчерпанными. С одной стороны, с каждым годом расширяется перечень соединений, для определения которых удобен этот метод, с другой — происходит непрерывный процесс его совершенствования увеличиваются чувствительность, точность и специфичность, уменьшается время анализа, упрощается методика, разрабатываются способы автоматизации с помощью биохимических роботов и компьютеров. Важное значение для совершенствования иммуноферментного анализа как метода имеет более детальное изучение физико-химических свойств ферментов и создание высокочувствительных методов детекции нх активности. [c.122]

Метод определения активности фермента должен быть по возможности точным, чувствительным, непрерывным, удобным и специфическим для изучаемой реакции. Однако чаще всего выполняются далеко не все эти требования. Поэтому, прежде чем признать метод пригодным для использования, необходимо провести многочисленные контрольные и стандартные тесты. Ниже приведено краткое описание этих тестов. [c.386]

Методы измерения активности ферментов делят на две группы одни основаны на остановке реакции через определенные промежутки времени, в других прирост продукта или убыль субстрата регистрируются непрерывно. [c.208]

Активность иммобилизованных ферментов можно определить практически всеми известными методами (непрерывными и периодическими, спектрофотометрическими, рН-метрическим, флуоресцентными, химическими и др.). При работе с иммобилизованными ферментами не-> обходимо постоянно перемешивать реакционную смесь в процессе из--мерения активности, так как в противном случае по мере оседания частиц носителя активность будет уменьшаться. При определении активности ферментов методом отбора проб обычное осаждение белка (например, трихлоруксусной кислотой) в случае иммобилизованных препаратов можно заменить отделением фермента фильтрованием или центрифугированием. [c.298]

Имеется ряд других примеров сопряженных химических реакций. Однако в непрерывных методах определения активности ферментов значительно шире используются сопряженные ферментативные реакции. Принцип здесь прост, однако встречается много подводных камней , особенно при использовании этого метода для определения активности в сыром экстракте. Продукт Р превращается сопрягающим ферментом Ер в другой продукт Q [c.296]

Широкое распространение приобрели методы определения активности с использованием вспомогательных ферментов. Они основаны на том, что продукт изучаемой реакции служит субстратом вспомогательного фермента. Этот метод имеет особое преимущество в тех случаях, когда непрерывная регистрация скорости изучаемой реакции затруднена или когда продукт реакции является ингибитором исследуемого фермента. [c.208]

Недавно для определения активности фермента был предложен экспресс-метод [74], позволяющий непрерывно регистрировать образование глюкозы непосредственно в спектрофотометрической кювете. При избытке глюкозооксидазы и пероксидазы в системе лимитирующей стадией сопряженной реакции является гидролиз целлобиозы и скорость образования окраски прямо пропорциональна скорости образования целлобиозы. Определение активности проводится в рН-оптимуме целлобиазы (pH 4,5-5,0), занимает 2-10 мин Метод позволяет в 10-20 раз повысить чувствительность определения целлобиазной активности. Недостатком данного способа является, прежде всего, нестабильность реагента при хранении даже в течение дня. [c.140]

Особый интерес придает этому методу его главная особенность — непрерывная фермент-субстратная реакция в течение всего опыта в ультрацентрифуге, из-за чего метод и получил название седиментация активного фермента (САФ). Поэтому коэффициент седиментации, определенный в таких опытах, отражает динамическое состояние реагирующего фермента и может отличаться от коэффициента седиментации, измеренного в обычных опытах без субстрата [5]. [c.176]

При незначительной модификации проточной системы ферментный термистор можно использовать для определения активности растворенного фермента. Исследуемый раствор фермента и раствор соответствующего субстрата (в относительном избытке) пропускают порознь через теплообменник затем их смешивают, быстро пропускают через один из коротких внутренних теплообменников для устранения тепла, выделяемого при смешении растворов, и направляют в реакционную камеру (объемом 1 мл). Последняя устанавливается вместо обычной ферментной колонки и представляет собой либо неактивную колонку, либо тефлоновую трубку, образующую реакционную спираль . Температуру на выходе реакционной камеры непрерывно измеряют одним из термисторных датчиков, как описано в разделе 29.2. Для большого числа разных ферментов обнаружена линейная корреляция между температурным откликом и активностью фермента [6]. Чувствительность метода-0,01-0,1 ед. активности/мл в зависимости от типа фермента. Калориметрическое определение активности растворенных ферментов может представить интерес для клинического анализа, а также для контроля процессов очистки ферментов. Хотя абсолютная чувствительность этого метода невелика, он имеет свои достоинства, так как позволяет проводить прямые непрерывные измерения в потоке. Его можно применять для анализа неочищенных проб, расходуя недорогие субстраты (здесь нет необходимости в дорогостоящих субстратах, дающих окрашенные продукты). [c.467]

Все рассмотренные количественные методы определения активности рестрикционных ферментов выполняются путем отбора проб в ходе реакции и их анализа. Халфордом и Джонсоном [114] был предложен и реализован на примере КЕсоК I непрерывный способ регистрации кинетики реакции. Он основан на разной способности связывать этидиум бромид сверх-скрученной и пикированной формами кольцевых молекул ДНК. Это приводит к изменению флуоресценции, что и регистрируется при помощи флуориметра. [c.129]

ДО полного изменения в расположении пептидных цепей. Развертывание пептидных цепей при денатурации подтверждается тем, что денатурированные белки дают более интенсивные цветные реакции, чем нативные белки. Это было впервые установлено для реакций на сульфгидрильные группы цистеина и на дисульфидные группы цистина [136]. Реакция с нитропуссидом, титрование железосинеродистым калием [39], ацетилирование [137] и полярография [138] — все эти методы определения сульфгидрильных и дисульфидных групп показали, что число этих групп в денатурированных белках больше, чем в тех же белках, находящихся в нативном состоянии. Денатурированные белки дают также более интенсивные цветные реакции на тирозин с фосфорномолибденовой кислотой [139, 140] и с диазореактивом [141], а на аргинин с реактивом Сакагуши [142] и присоединяют большие количества иода [143]. В то время как в нативном лакто-глобулине только 12 -аминогрупп лизина реагируют с динитрофторбензолом, в денатурированном лактоглобулине эту реакцию дает 31 е-аминогруппа, т. е. все содержащиеся в нем е-аминогруппы [144]. Таким образом, все приведенные данные подтверждают ту точку зрения, что при денатурации в связи с развертыванием пептидных цепей становятся доступными те активные группы, которые в нативных белках недоступны для соответствующих реактивов. Подобным же образом можно объяснить меньшую устойчивость ряда денатурированных белков по отношению к действию трипсина. Как известно, многие денатурированные белки гораздо легче расщепляются трипсином, чем те же самые белки в нативном состоянии. Это можно рассматривать как следствие того, что при денатурации разрываются связи, тесно удерживающие пептидные цепи друг около друга, и обнажаются те пункты, на которые может воздействовать фермент [146, 147]. Можно полагать, что трипсин, гидролизуя (хотя и медленно) нативные белки, гидролизует, в сущности, содержащиеся в них следы денатурированных белков. При этом процессе должно происходить непрерывное нарушение равновесия в системе нативный белок—денатурированный белок и смещение этого равновесия в правую сторону. [c.149]

Хотя эта модель является весьма упрощенной, она объясняет, почему уравнение Аррениуса оказывается неприменимым для описания температурной зависимости ферментативных реакций при высоких температурах. В ранних работах по ферментативной кинетике обычно приводился такой параметр, как оптимальные температуры для ферментов. Однако следует отметить, что температура, при которой Анабл достигает максимального значения, с практической точки зрения не имеет особого смысла, поскольку, как оказалось, характер температурной зависимости ферментативных реакций зависит от постановки эксперимента. В частности, чем дольше инкубируется реакционная смесь перед определением активности, тем ниже наблюдаемая оптимальная температура . Объясняется это тем, что денатурация, как правило, протекает довольно медленно, и, следовательно, эту стадию нельзя рассматривать как равновесную. Степень денатурации растет с увеличением времени инкубации, что нетрудно обнаружить современными экспериментальными методами при непрерывной регистрации ферментативной реакции выявляются протекающие во времени процессы. [c.158]

Чтобы измерить активность фермента, необходим метод определения количества образовавшегося продукта (или иногда количества израсходованного субстрата). Такой метод может включать стадию разделения субстратов и продуктов после реакции можно также измерять концентрацию одного из компонентов смеси независимо от присутствия другого. Удобно разделить способы измерения активности ферментов на две группы периодические (stopped) и непрерывные методы. Последние будут рассмотрены в следующем разделе. Непрерывные методы позволяют следить за ходом реакции во времени, не прерывая ее течения, что является большим преимуществом. Однако непрерывные методы имеют ряд ограничений, и для многих ферментов нет подходящих способов таких измерений. Периодиче- [c.286]

Изложив принципы периодических и непрерывных способов определения ферментов, можно сравнить их относительные преимущества и недостатки. Это уже частично было сделано выше в табл. 8.3 дано систематическое их сопоставление. В заключение необходимо упомянуть о так называемом непрерывно-периодическом методе. Используя автоматическую систему тестирования ферментов, можно отбирать пробы из реакционной смеси и после остановки в них реакции измерять количество продуктов реакции, получая таким образом непрерывный ряд значений ферментативной активности. Пример, приведенный на рис. 8.13, показывает, каким образом этот метод применяется для тестирования фосфатобразующих ферментов. Таким же способом можно проводить множество других определений, которые раньше выполнялись только с помощью периодических методов. [c.306]