Моноклональные скрининг

Для выявления молекул клеточной поверхности, участвующих в межклеточной адгезии, белки плазматической мембраны солюбилизируют, отделяют друг от друга и каждую фракцию испытывают на способность нейтрализовать действие фрагментов антител, блокирующее агрегацию клеток (этапы 3 и 4). Затем фракции, проявившие такую способность, очищают и вновь тестируют до тех пор, пока не будет получен чистый белок (этот процесс на схеме не показан). Другой Иммунологический подход состоит в получении большого числа моноклональных антител (разд. 4.5.4) к антигенам клеточной поверхности и их скрининге для выявления тех, которые будут блокировать межклеточную адгезию. Оба иммунологических метода основаны на важном общем наблюдении простое нанесение на клеточную поверхность антител само по себе не препятствует нормальной клеточной адгезии адгезия блокируется только тогда, когда мишенями для связывания антител служат специфические молекулы клеточной [c.518]

Для скрининга могут использоваться моноклональные антитела или поликлональная антисыворотка. [c.174]

Для скрининга можно использовать моноклональные антитела или поликлональную сыворотку. [c.188]

Мы также приводим методику эффективной постановки вестерн-блот-анализа с использованием моноклональных антител (табл. 6.8). Исходя из нашего опыта, моноклональные антитела четко делятся на две группы антитела, работающие в таком анализе, и не работающие антитела. Работающие в блот-анали-зе антитела воспроизводимо эффективны, но никакими изменениями условий ренатурации белков нам ни разу не удалось сделать так, чтобы антитела, не работающие в блот-анализе, вдруг заработали. Интересно, что такие неработающие антитела оказываются достаточно эффективными при скрининге колоний (табл. 6.1), позволяя картировать их некоторые эпитопы. [c.197]

В разд. 5 мы рекомендовали выбирать метод скрининга, адекватный использованию МКА. Следует иметь в виду, что в неадекватных системах МКА иногда не обнаруживают антигена. Например, моноклональные антитела к растворимым белкам, отобранные методом пассивной гемагглютинации с помощью эритроцитов, нагруженных антигеном, могут распознавать только одну антигенную детерминанту. Такие антитела не обладают преципитирующими свойствами. В таком случае преципитация антигена достигается при использовании комбинации моноклональных антител различной специфичности, которые распознают две различные детерминанты на молекуле белка. [c.149]

ДОМ необходим определенный навык. Кроме того, при использовании этого метода для каждого типа тестируемых моноклональных антител необходимо подбирать индивидуальные оптимальные условия. По всем этим причинам метод ТСХ с последующим иммунным проявлением и радиоавтографией не пригоден для скрининга большого набора антител. [c.172]

Рис. 9.2. Скрининг клеток, вырабатывающих моноклональные антитела. Вьщеляют клетки селезенки мыши, иммунизированной специфическим антигеном, и проводят их слияние с клетками миеломы, не вырабатывающими антитела. Слившиеся клетки отбирают по способности к росту на среде ГАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Клетки, вырабатывающие специфические антитела к иммунизирующему антигену (клетки гибридомы), идентифицируют иммунологическими методами и субкультиви-руют, чтобы получить отдельные клоны. Из гибридомы, растущей в культуре и секрсти-рующей единственный тип молекул антител, получают моноклональные антитела.

Большинство антигенов вызывает в организме образование целого набора антител, но каждый отдельно взятый лимфоцит продуцирует лишь одно из них. Миеломы — это злокачественные новообразования иммунной системы они развиваются в результате неконтролируемой пролиферации одной линии лимфоцитов. При этом в больших количествах синтезируется один тип белков-антител. Иными словами, миеломы являются природными продуцентами моноклональных антител. По методу Миль-штейна проводят слияние нормальных (неопухолевых) лимфоцитов и клеток миеломы. Вначале полученные гибриды синтезируют смесь антител, включающую два типа антител родительских клеток, а также гибридные их формы, образующиеся путем ассоциации тяжелых и легких цепей антител двух родительских форм. Впоследств ии в результате элиминации хромосом образуются клетки, способные к синтезу антител лишь одного типа. Это могут быть либо антитела, закодированные в геноме лимфоцита, либо антитела, характерные для клеток миеломы. Скрининг и обнаружение клона, синтезирующего искомое антитело, ведут при помощи биохимических и иммунохими-ческих методов. Схема этого метода дана на рис. 7.5. [c.313]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

В распоряжении исследователя имеется охарактеризованная кДНК, но ему требуются антитела, поскольку 1) нужный белок содержится в клетке в небольшом количестве или его трудно очистить, 2) либо необходимо получить антисыворотку, специфичную к определенному участку или субъединице данного белка. Последний подход обладает значительно большей избирательностью, чем скрининг группы моноклональных антител, и гораздо проще, чем выделение пептидных фрагментов путем ферментативного или химического расщепления. [c.142]

Трудности, с которыми можно столкнуться при наработке моноклональных антител, связаны с получением достаточного количества иммуногена и последующим скринингом сыворотки для выявления нужной иммунологической активности. Использование гиперэкспрессии гибридных белков может облегчить преодоление этих трудностей, поскольку дает возможность выделять большие количества белкового продукта с помощью электрофореза или хроматографии. При скрининге сыворотки и полученных затем гибридных клонов можно применять метод радноиммунного анализа (РИА, RTA) или метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). [c.173]

При ТОЛЬКО что описанной процедуре исходные антитела (анти-Х) продуцируются всей иммунной системой кролика. Следовательно, эти антитела поликлональны, ибо их вырабатывают лимфоциты, обладающие разной степенью специфичности по отношению к X. Моноклональные антитела, вырабатываемые-клетками-потомками одного лимфоцита, можно получить соответствующим скринингом, отобрав лимфоциты желательной специфичности. Получение моноклональных антител обещает сильно увеличить специфичность иммуноцитохимических методов идентификации нейроактивных веществ в нейронах. Кроме того, этот общий метод можно приспособить для еще более тонких измерений, таких как визуализация специфической РНК, в которой закодирован синтез определенного пептида или белка (см. гл. 4). [c.221]

Недавно методом иммунохимического скрининга с помощью моноклональных антител к компонентам поверхности синап-тосом идентифицирован новый фосфопротеин Р 1-20 (N15. = 190 кД), который локализуется в синапсах головного мозга, причем его содержание начинает резко возрастать после 7 дня постна-тальной жизни животного. Показано, что этот фосфопротеин является так же, как и фодрин (см. раздел 3.1), субстратом для калпеина нейронов. [c.76]

СЛИЯНИЯ гибридом с родительскими миеломами, имеющими особенно благоприятные характеристики. Кроме того, большое поле деятельности открывается в области инженерии моноклональных антител. Эта технология позволит создавать новые типы моноклональных антител с заранее заданными свойствами и получать их в больших количествах. Необходимо также развивать методы скрининга для поиска клонов, секретирующих антитела при культивировании на бессывороточных средах. [c.50]

Планшеты с пористой нитроцеллюлозой. Разработан модифицированный метод скрининга моноклональных антител против поверхностных антигенов раковых клеток различных типов [32 ]. В этом методе используются 96-луночные микропланшеты, в дно лунок которых вплавлены пористые нитроцеллюлозные мембраны. Небольшое количество жизнеспособных раковых клеток наносили на пористое дно лунок микропланшетов (Millipore orpo н инкубировали с супернатантом культуральной жидкости гибридом. [c.132]

Моноклональные антитела. Доступность антимышн-ных IgG, меченных европием, позволила разработать простые методики скрининга клонов, продуцирующих антитела. Метод DELFIA дополняет существующие иммуноферментные методы скрининга моноклональных антител. [c.163]

Метод количественного определения поликлональных или моноклональных антител. Система лабораторного скрининга МКА, титрования АТ и определения изотипч АТ в процессе иммунного ответа [c.28]

Необходимо хорошее оборудование для работы с культурами, в том числе СОг-термостат (содержание СОг в воздухе — 5%)- Желательно иметь ламинарный бокс для осуществления манипуляций в стерильных условиях. Следует отметить, что знание основ асептики и некоторый опыт в работе с клеточными культурами важны для успешного проведения работ. Для визуального наблк>дения за культурами необходим инвертированный микроскоп (например, Olympus СК модель снабжена широкой ровной подста вкой, объективом ХЮ и бинокулярной насадкой WF 15Х). Кроме контейнеров с жидким азотом для хранения плазмацитом и гибридом, для получения моноклональных антител необходимо не так уж много специального оборудования. Позднее будут рассмотрены возможные варианты процедур скрининга, которые, по-видимому, следует усовершенствовать и более широко внедрять в практику. Для иммунизации необходимо иметь инбредные линии мышей (обычно BALB/ ) или крыс (Lou). Если предполагается выращивать гибридомы в виде асцитных опухолей, то понадобится довольно большое количество животных. [c.117]

Выбор используемой процедуры скрининга зависит от дальнейшего возможного использования моноклональных антител. Другими словами, если вы намерены получить моноклональные антитела, которые предполагаете использовать для лизиса клеток в присутствии комплемента, то и для скрининга следует использовать соответствующий тест (реакцию комплемент-за-висимого лизиса). Подобно этому, если моноклональные антитела предполагается использовать в реакциях преципитации илн для окрашивания заключенных в парафин препаратов тканей при иммуногистологических исследованиях, то именно эти методы и должны использоваться для скрининга гибридом. Тест, используемый для скрининга, в идеале должен удовлетворять следующим критериям [c.134]

Суммируя вышесказанное, можно утверждать, что тесты, обычно используемые в лаборатории при исследовании поликлональных сывороток с высокими титрами антитегл, могут быть адаптированы для скрининга гибридом. Некоторые из них могут оказаться довольно сложными например, цель исследователя может заключаться в получении моноклональных анти- [c.135]

Дальнейшие исследования возможностей использования моноклональных антител неожиданно встретили затруднения, обусловленные распознаванием моноклональными антителами только нативной формы антигена. Например, моноклональные антитела к клеточным антигенам часто не распознают антиген, перенесенный на нитроцеллюлозную мембрану с полиакриламидных гелей после проведения электрофореза растворимых клеточных экстрактов в присутствии ДСН. В данном случае антиген денатурируется и поэтому не связывается с антителами. Подобным образом моноклональные антитела, которые окрашивают клетки в суспензии, могут оказаться непригодными для иммуногистологических исследований парафиновых срезов зафиксированного формалином материала. Эти соображения наводят на мысль, что как выбор метода скрининга, так и природа материала, используемого для иммунизации мышей, являются важными факторами, влияющими на свойства полученных в конечном итоге моноклональных антител. [c.149]

Располагая системой ИФА, в которой видимая глазом окраска развивается при содержании в образце антигена в концентрации, соответствующей некоторому положительному диагнозу, можно разработать простой метод эффективного скрининга многочисленных пациентов. Так, с использованием двухцентрового ферментативного иммунометрического анализа на базе моноклональных антител была разработана методика определения беременности, основанная на обнаружении в крови хориогонадотропина. [c.394]

Для того, чтобы выделить из клонотеки пептиды с искомой биологической активностью, применяют различные методы скрининга. В частности, для выделения пептидов, имитирующих определенные эпитопы, используют биотинилированные моноклональные антитела (mAb) соответствующей специфичности, которые иммобилизуют на твердой подложке с помощью стрептавидина (рис. 47). Фаговые частицы, экспрессирующие на своей поверхности соответствующие эпитопы, взаимодействуют с антителами и задерживаются подложкой, тогда как другие рекомбинантные фаговые частицы удаляются в процессе промывания. Задержанные на подложке фаговые частицы элюируют буфером с низкими значениями pH, индивидуальные клоны дополнительно размножают в бактериальных клетках, и экспрессированные на них эпитопы исследуют по различным критериям. Наличие идентичных или сходных последовательностей нуклеотидов среди клонированных последовательностей свидетельствует о специфичности процесса очистки. Индивидуальные клоны затем охарактеризовывают другими, в частности иммуноферментными методами. На заключительной стадии осуществляют синтез выделенных пептидов и их всестороннее изучение в очищенном состоянии. [c.342]

Иммунологические методы. Эти методы применяют для выявления определенных клонов с рекДНК, если клонируемые гены экспрессируются. Напомним, что молекулы белков имеют по несколько антигенных детерминант (эпитопов), на каждый из которых в организме животных вырабатывается свое антитело (специфический иммуноглобулин). Сыворотки, получаемые стандартными методами, поликлональны, т. е. содержат антитела ко многим эпитопам данного белка. Возможно получение и моноклональных антител, если использовать гибридомы (см. рис. 5.8). Хотя моноклональные антитела при скрининге дают небольшой фон ошибочных положительных ответов, используют обычно поликлональные антитела. Это связано с тем, что детектируемым белок может иметь в чем-то измененную структуру или присутствовать в виде фрагмента. [c.283]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология