Ферментативные методы гидролиза белков

Ферментативные методы гидролиза особенно ценны благодаря присущей им во многих случаях специфичности. Трипсин, представляющий собой так называемую эндопептидазу, быстро расщепляет пептидные связи лишь в том случае, если карбонильная группа расщепляемой амидной связи принадлежит одной из основных аминокислот — лизину или аргинину. Таким образом, трипсин превращает белок в сравнительно малое число триптических пептидов, которые можно разделить и охарактеризовать. Трипсин расщепляет только денатурированные белки, причем для получения хороших результатов нужно предварительно разорвать дисульфидные мостики. [c.166]

На следующем этапе исследования белок подвергают ферментативному гидролизу на пептиды, например под действием трипсина, химотрипсина и пепсина. Разделение пептидов осуществляют с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге. Затем, пользуясь ДНФБ-методом, определяют аминокислотную последовательность, начиная с Ы-конца. [c.289]

Создание твердофазных носителей для анализа последовательности [55] стимулировало разработку мощного метода селективного выделения С-концевых пептидов. В принципе можно селективно присоединить белок к смоле через С-концевой карбоксил белка, химически или ферментативно расщепить иммобилизованный белок и селективно выделить С-концевой пептид, поскольку после гидролиза только он останется присоединенным к смоле. Однако на практике при активации С-концевого карбоксила активируются и карбоксильные группы боковых цепей Asp и Glu, которые затем связываются с носителем [51], что ограничивает возможности использования таких смол в качестве общего метода селективного выделения С-концевых фрагментов белков. [c.483]

Были синтезированы конъюгаты сывороточного альбумина человека с аденозиндезаминазой — ферментом, катализирующим гидролиз аденозина с образованием инозина и аммиака. Для регистрации ферментативной активности использовали чувствительный к аммиаку ионселективный электрод. Метод прост и. позволяет определить белок в концентрации 1 мкг/мл. [c.118]

Биораспознающий компонент биосенсора—это белок, макромолекула или комплекс со специфической поверхностью или внутренними распознающими центрами, необходимый для распознавания определяемого вещества. Компонент обусловливает селективность по отношению к определяемому веществу и передает сигнал на преобразователь. Тип реакции, катализируемой фермен> том, определяет выбор преобразователя. Определяемое вещество, а значит, и доступньк методы преобразования обусловливают природу биораспознающего компонента. Рассмотрим два примера, в которых фермент используют для создания сенсора на субстрат этого фермента. На схеме 7.8-1 ферментативная реакция включает перенос злектрона таким образом, для определения холестерина можно использовать в качестве преобразователя амперометрический электрохимический сенсор. Схема 7.8-2 включает изменение [Н+1 следовательно, контроль превращения ацетилхолина возможен с помощью рН-электрода или рН-чувствительного красителя в оптическом приборе. Другие ферменты можно использовать в случае реакций гидролиза, этерификации, расщепления и т. д. определяемое вещество обычно является субстратом фермента. (Как можно провести анализ, если вы не смогли найти подходящую ферментативную реакцию с участием определяемого вещества, ио знаете, что оно является иигибитором ферментативной реакции ) [c.519]

Полное ферментативное расщепление белков проводят с помощью смеси ферментов, которую составляют протеазы, синтезируемые грибами (проназы). Однако ферменты смеси расщепляют еще и друг друга, так что в общем случае для количественного расщепления белка на составляющие его аминокислоты ферментативный гидролиз не годится. Один из новых методов основан на применении гидролитических ферментов, иммобилизованных на колонках с агаровым гелем. Гидролизуемый белок пропускают через гель, после чего на дне колонки скапливаются составляющие его аминокислоты [132]. [c.168]

Гликоген — гомополисахарид, построенный из D-глюкозы. Методами метилирования , периодатного окисления " , частичного кислотного гидролиза и ферментативного pa щeплeния " доказано, что он является ближайшим аналогом амилопектина (см. стр. 534), т. е. обладает ветвистой структурой, построенной из а-1—4-связанных остатков D-глюкопиранозы со связями а-1 6 в точках разветвления. Отличие от амилопектина сводится к большей разветвленности и более тесной упаковке полимерной молекулы . Так, типичные гликогены имеют среднюк> длину цепи 10—14 моносахаридных остатков, из которых на внешние цепи приходится 6—10, а на внутренние —2—4 (см. рис. 11). В соответствии с этим р-амилаза гидролизует гликоген только на 40—50%, а R-фермент, расщепляющий связи а-1- 6 в амилопектине и р-декстринах, на гликоген не действует, по-видимому, из-за пространственных затруднений, создаваемых высокой степенью разветвленности . С другой стороны, конка-навалин-А—белок, не взаимодействующий с амилопектином, образует с гликогеном нерастворимый комплекс, причем существует линейная зависимость между способностью к комплексообразованию и степенью разветвления полисахарида . [c.540]

В результате ферментативного воздействия, определяли последовательно после каждого отщепления Ы-концевого остатка по методу Эдмана (см. гл. 6). При изучении гемоглобина (Брауницер был удачно применен последовательный гидролиз белка разными про-теолитическими ферментами. В этом случае на белок действовали трипсином, а затем полученные пептиды гидролизовали пепсином, специфичность которого значительно повышали, ограничивая время реакции. Методические трудности, связанные с фракционированием сложных гидролизатов и определением полной структурной формулы белка, были преодолены в результате упорного труда нескольких групп ученых. Мы теперь знаем полную аминокислотную последовательность инсулина, глюкагона, рибонуклеазы, гемоглобина, белка вируса табачной мозаики, а также кортикотропина и других пептидных гормонов приближаются к завершению работы по установлению строения папаина, лизоцима, химотрипсиногена, трипсииогена, цитохрома с успешно продвигается изучение некоторых других белков. Изучение последовательности аминокислот проводилось на частичных кислотных гидролизатах или на гидролизатах, полученных при действии различных протеолитических ферментов. Чисто химические методы избирательного расщепления пептидных цепей не имели до сих пор значительного успеха, и эта область остается еще нерешенной задачей пептидно химии. [c.117]

Гидролиз белка можно проводить и при помощи протеолити-ческих ферментов. Хотя ферментативный гидролиз белка протекает при очень мягких условиях, он редко применяется для препаративных целей, так как для полного гидролиза требуется очень много времени. Недочетом этого метода является и то, что гидролизаты загрязняются продуктами расщепления фермента, который также представляет собой белок. [c.24]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология