Другие методы расщепления пептидных связей

Другие методы химического расщепления пептидных связей [c.122]

Разработаны химические методы специфического расщепления пептидных связей и по остаткам других аминокислот, однако они не нащли столь широкого применения. В настоящее время, когда по методу Эдмана можно анализировать крупные белковые фрагменты, наиболее целесообразными представляются методы расщепления по относительно редко встречающимся аминокислотным остаткам, таким как Тгр и Met. [c.273]

Другие методы расщепления пептидных связей [c.126]

Химики-органики до настоящего времени не достигли существенных успехов в разработке методов селективного расщепления белков, однако имеющиеся данные о последовательности сцепления аминокислот и стандартизация методов определения концевых групп при расщеплении пептидных связей создают основу для исследования новых методов. Доступность инсулина с точно установленным количественным составом [223] и других белков в сравнительно чистом виде должна послужить стимулом для дальнейшего изучения проблемы селективного расщепления. [c.166]

При проведении исследования этим методом на стадии восстановления и перегруппировки встречаются трудности. Так, при восстановлении крупных пептидов, не растворимых в реакционной среде, для получения удовлетворительных результатов требуется повышенная температура. Кроме того, восстановительное расщепление пептидных связей, особенно связей, образованных карбоксильными Труппами глицина и аланина, может протекать другим путем [c.248]

В реакции окислительного расщепления пептидной связи тирозина N-иодосукцинимид столь же эффективен, как и N-бромо-сукцинимид. Реакцию проводят при pH 4,5, выход на модельных соединениях и простых тирозинсодержащих пептидах составляет 25—95%. Механизм реакции идентичен расщеплению с помощью N-бромосукцинимидом [100]. Показано, что пептидная связь тирозина расщепляется с умеренным выходом при электролитическом окислении на платиновом электроде. При этом в отличие от реакции с N-бромосукцинимидом не наблюдается расщепления по триптофану и гистидину однако идет окисление других функциональных групп (имидазоль-иых, тиоэфирных, дисульфидных и аминогрупп), правда с меньшей скоростью, чем фенольных групп тирозина. С помощью этого метода были специфически фрагментированы по остатку тирозина ангиотензин, инсулин и рибонуклеаза [30]. [c.118]

Совершенно ясно, что требованиями, предъявляемыми к любому методу ступенчатого отщепления концевых групп, являются высокий выход продукта отщепления на каждой стадии и отсутствие одновременного расщепления других пептидных связей. Рассмотрение наиболее удачного метода отщепления концевых групп — метода Эдмана — приводит к выводу, что оптимальные условия расщепления еще оконча- [c.238]

F. G > 3 другой — СВЯЗЬ. .. Н. I... Применим оба метода расщепления к нашей модели. Первый метод даст два пептида А. В. С. D. Е. F. и G. И. I. J. К. L. М. N. Второй метод даст также два пептида А. В. С. D. Е. F. G. И. и I. J. К. L. М. N. Последовательность исходного пептида определяют на основании анализа четырех полученных фрагментов. Для этого нужно определить их аминокислотный состав, а также N- и С-концевые группы. Аминокислотную последовательность этих малых пептидов удается определить путем поэтапного расщепления, дальнейшего частичного гидролиза и определения концевых групп получившихся более мелких фрагментов. При этом возникает возможность выявить перекрывающиеся последовательности пептидных фрагментов. Например, часть G. Н... пептида, полученного первым методом расщепления, имеет такую же последовательность, как и С-концевая часть фрагмента. .. F. G. Н.— одного из пептидов, полученных вторым методом. По принципу собирания мозаики мы может восстановить структуру исходного пептида на данном участке. [c.33]

Если порядок чередования аминокислот в коротких цепях, хотя и с трудом, но поддается определению, то в отношении длинных пептидных цепей, содержащих 100 и более аминокислот, мы не располагаем в настоящее время никакими методами, которые позволили бы сделать это более или менее полно. Некоторые авторы пытались разрешить ряд вопросов в данном направлении путем исследования продуктов частичного гидролиза белков, осуществляемого концентрированной соляной кислотой при температуре 30, 45 и 60°. Эти исследования показали, что одни пептидные связи более стабильны, чем другие, и что расщепление связей при данном методе гидролиза происходит только в некоторых точках [c.135]

Последовательность аминокислотных остатков в белковой цепи называется ее первичной структурой. Определение первичной структуры производится путем частичного гидролиза белка с помощью протеаз, катализирующих расщепление пептидной связи лишь нежду определенными остатками. Так, трипсин режет лишь связи, образованные СО-группами остатков основных аминокислот — Apr или Лиз. В результате образуется смесь пептидов — коротких фрагментов белковой цепи. Их идентификация производится посредством химических и физико-химических методов (хроматография, электрофорез). Воздействуя вторым ферментом, можно разрезать другие связи в белке и получить смесь других фрагментов (пептидов) и т. д. [c.33]

Последовательность аминокислотных остатков в полипептид-,ной цепи называется ее первичной структурой. Определение пер.-вичной структуры производится путем частичного гидролиза белка с помощью специфических протеаз, катализирующих расщепление пептидной связи лишь между определенными остатками. Так, трипсин атакует лишь те пептидные связи, которые образованы СО-группами остатков основных аминокислот — Apr или Лиз. В результате образуется смесь коротких полипептидных цепей, олигомеров. Такие короткие цепи называются пептидами. Их исследование производится посредством химических и физико-химических методов (хроматография, масс-спектроскопия). Воздействуя другим ферментом, можно разрезать белок по другим связям, получить смесь других пептидов. N- и С-конце-вые остатки белка (см. стр. 68) определяются в результате их химической модификации, предшествующей частичному гидролизу. Зная строение пептидов, полученных при специфическом расщеплении различными ферментами, можно установить первичную структуру белка. Допустим, что белковая цепь имеет структуру [c.73]

Дисульфидные связи можно восстанавливать с помощью других реагентов однако эти методы не находят применения в аналитической химии белка. Например, восстановление борогидридом натрия (при pH 7—10) сопровождается расщеплением пептидных связей [35] при реакции с дибораном идет восстановление карбоксильных групп (в виде карбоксилат-иона) в гидроксильные [5, 6]. В принципе диборапами можно восстанавливать белки с непротонированпыми карбоксильными группами. Редко в химии белка применяется электролитическое восстановление на ртутном капельном электроде [27, 111]. [c.86]

N-ацилирование проводят в присутствии большого избытка уксусного или муравьиного ангидрида. Для последующего секвенирования пептидных фрагментов необходимо провести гидролиз ацильных групп. Формильную защиту снимают кратковременной обработкой НС1 в метаноле при комнатной температуре, более устойчивые ацетильные группы отщепляют 0,01 М КОН. Из других методов расщепления 0-пептидных связей следует упомянуть реакцию с гидроксиламином или гидразином с образованием гидроксамовых кислот или гидра-зидов N-концевых партнеров гидроксиаминокислот (серина и треонина) для этих целей применяли также 1М пиперидин [64]. Относительно определения ацетильных и формильных групп см. разд. 8.13. [c.94]

Согласно предложенному методу белок в 80%-ной уксусной кислоте обрабатывают о-иодозобензойной кислотой в присутствии 4 М гуанидин-НС1 [120]. Реакция идет избирательно с выходом 70—100%. Однако последующие исследования показали, что метод не столь специфичен, а выход не столь высок, как сообщалрсь [51—54, 99, 198]. По выходу продуктов реакции предложенная методика сопоставима с другими, где происходит расщепление по триптофану кроме того, побочно идет расщепление по остатку тирозина. Более детальные исследования показали [52, 53], что в указанных условиях (80%-пая уксусная кислота, 4 М гуаиидин-НС1) происходит окислительное галогенирование индольного ядра триптофана и бензольного кольца тирозина с одновременным расщеплением пептидной связи. Если из реакционной смеси исключить галоген, расщепления пептидной связи не происходит. Меха- шзм реакции, вероятно, аналогичен другим реакциям с использованием галогенирующих реагентов (в том числе Ы-бро-мосукцинимида). Высказано предположение, что при инкубации [c.112]

Другой окислитель, бромциан, — более надежный реагент [26] Он разрушает пептидные связи, в которых участвует остаток метио нина. Механизм этой реакции подобен расщеплению иодацетами дом [45]. Окисление бромцианом широко применяют как специ фичный метод для получения крупных пептидных фрагментов Весьма успешно он был использован наряду с другими методами при расшифровке аминокислотной последовательности рибонуклеазы [27], миоглобина [17], трипсиногена [36] и альдолазы [42, 68,69]. [c.37]

Благодаря отличиям в массах соответствующих фрагментов можно различить все три аминокислоты. К сожалению, этот довольно изящный метод имеет недостатки, из-за чего область его применения ограничена. Наиболее серьезный недостаток состоит в том, что побочные продукты, которые могут образоваться при неполном восстановлении, невозможно выделить. Когда имеют дело со смесью пептидов неизвестного состава, трудно отличить истинное производное от побочного продукта, так как последний также может детектироваться в газовом хроматографе. Еще одна побочная реакция в результате разрывов пептидных связей при восстановлении может привести к появлению новых соединений (свободных аминов и альдегидов), которые еще более усложняют картину. Известно, что при восстановлении третичного амида с помощью LiAIH4 происходит расщепление амидной связи и образуются альдегиды и амины [104]. Подобные реакции расщепления уже наблюдали для пролиновых пептидов [74]. Они встречаются также в ходе восстановления пептидов другими гидридами металлов [63]. Мы вынуждены признать, что этот метод может применяться только для не слишком сложных смесей нескольких простых аминокислот. Но даже при таком ограничении его важным преимуществом является то, что для анализа требуется очень небольшое количество вещества (несколько миллиграммов). [c.341]

Каждый из этих ферментов атакует вполне определенные пептидные связи. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, карбонильная группа которых принадлежит одной из основных аминокислот, обычно аргинину или лизину. Пепсин и химотрипсин предпочтительно катализируют гидролиз тех пептидных связей, в образовании которых участвуют ароматические аминокислоты, в частности триптофан, тирозин и фенилаланин. Среди протеолитических ферментов наиболее высокой специфичностью обладает трипсин поэтому именно он наиболее подходит для такого рода анализа. Ясно, однако, что при помощи только одного, пусть даже абсолютно специфичного, фермента невозможно определить полную последовательность аминокислот в полипептиде. Если, например, триптическое расщепление полипептида дало пять фрагментов (пептидов), в сумме соответствующих всей цепи, и если даже для каждого из них удалось установить аминокислотную последовательность, то это еще не все требуется узнать, в каком порядке эти пептиды располагались в нативном полипептиде. Чтобы узнать это, необходимо получить другие пептиды, которые перекрывались бы с первыми. Главное преимущество ферментативного гидролиза — специфичность реакции расщепления в отношении природы расщепляемых пептидных связей накладывает в то же время строгое ограничение на применимость этого метода. В идеале желательно было бы, например, иметь возможность расщеплять иногда те пептидные связи, которые в норме трипсином не атакуются, или, наоборот, предохранять от расщепления связи заведомо чувствительные. Недавно были предложены некоторые модификации методики, которые позволяют в какой-то мере решить эту задачу. Так, например, реакция е-аминогруппы лизина с этилтрифтортиоацетатом в слабо щелочном растворе дает блокированный по аминогруппе остаток, пептидная связь которого не атакуется трипсином [c.90]

Другая возможность введения заместителей в карбоксильную группу — это образование амида или гидразида. Метод защиты путем амидообразования применяется сравнительно редко, поскольку селективное расщепление амидной группировки без разрыва пептидных связей, как и в случае Ы-защнт-ных групп ацильного типа, можно осуществить далеко не всегда. Превращение кислоты в гидразид также нельзя рассматривать как вполне удовлетворительный способ защиты карбоксильной группы, так как в процессе пептидного синтеза может происходить ацилирование гидразидной группировки. Правда, эта нежелательная побочная реакция предотвращается путем блокирования гидразидной функции введением Ы-защитной группы. В настоящее время приобретает все большее значение, особенно для синтеза высших пептидов, защита карбоксильной группы с помощью солеобразования. [c.87]

Ацильная миграция была положена в основу разработки химического метода специфического расщепления пептидной цепи по амидным связям, образованным остатками серина или треонина. Методика, нашедшая применение в случае фиброина шелка, состоит в обработке белка концентрированной серной кислотой. Образующиеся в результате такой обработки аминогруппы алкилируют 2,4-динитрофторбензолом и аминокислоты определяют в виде динитрофенильных производных ([660] ср. [540а]). Этот метод применяли и для изучения других белков [1787, 2573]. Действием концентрированной серной кислоты можно почти полностью превратить поли-оь-серин в соответствующий полиэфир [708]. Однако были отмечены низкие выходы, неспеци- [c.279]

Специфичность. Гидролиз тромбином проходит по С-концевой пептидной связи остатков аргинина типа -Arg-X-. В нативном субстрате фибриногене этой связью является -Arg-Gly-, в других белках в качестве остатка X может быть аланин, aprii-нин, аспарагиновая кислота, цистеин, валин [64]. Наблюдаетс51 также гидролиз по связи -Arg-His- в кальмодулине [108]. Обработка тромбином приводит к расщеплению только очень ограниченного числа пептидных связей аргинина, и, следовательно, этот метод можно считать идеальным для получения крупных фрагментов белка, предназначенных для автоматического секвенирования. В некоторых случаях тромбин даже в жестких условиях гидролизует в белке только одну пептидную связь, в других случаях степень гидролиза зависит от продолжительности ])еакции и температуры. Соответствующие примеры приведены в работе [106]. [c.150]

Два главных препятствия до сих пор ограничивают пределы возможностей автоматического ЖФ-метода Эдмана [32]. Первой проблемой является перенос остаточных аминокислот на каждый последующий цикл. Это явление происходит как из-за неполного присоединения реагента к белку, так и из-за неполного отщепления модифицированной N-концевой аминокислоты в виде 2-анилинотиазолинона другая проблема заключается в том, что па стадии кислотной обработки карбамоилпеп-тида (белка) происходит расщепление внутренних неустойчивых пептидных связей, приводящее к появлению новых полипептидных цепей, т. е. новых последовательностей. В результате этих двух процессов накопление фона ФТГ-аминокислот достигает такого уровня, что однозначная идентификация последовательности аминокислот основной цепи становится невозможной, Для снижения уровня остаточных пиков было предложено проводить и конденсацию, и отщепление АТЗ дважды в каждом цикле [31]. Однако такое изменение стандартной методики приводит к большим потерям пептида (вымывание из реактора). Для снижения этих потерь в реактор добавляют носители-белки или органические полимеры [78, 92], но, к сожалению, белки подвержены ацидолизу, в результате чего возникают ложные последовательности. Для снижения уровня остаточных аминокислот, появляющихся в результате неполного взаимодействия ФИТЦ с полипептидами (особенно если Pro—N-концевой остаток), повышают температуру реактора до 55°С [94]. [c.456]

Пептиды, полученные при специфическом химическом или ферментативном расщеплении белка, разделяют методами хроматографии. Далее последовательность аминокислот в каждом из пептидов определяют методом Эдмана. Таким образом, достигается этап, когда последовательность аминокислот в отдельных пептидах (фрагментах белка) известна, но остается невыясненной последовательность самих пептидов. Последнюю устанавливают с помопшю так называемых перекрывающихся пептидов (рис. 231). При этом используют уже не трипсин, а какой-либо фермент, расщепляющий по шпептидную цепь в других участках, например химотрипсин, который расщепляет пептидные связи главным образом по [c.30]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология