Синтезы на твердофазных носителях

Рис. 5. Схема твердофазного синтеза олигонуклеотидов амидофосфитным методом П - полимерный носитель, Ру-пиридин.

Жидкофазный пептидный синтез похож на твердофазный метод (гл. 2) тем, что синтез происходит на полимерном носителе (т. е. полиэтиленгликоле). Однако полимер растворим в используемой системе растворителей, так что протекает гомогенная реакция. Этот метод не нашел столь широкого применения, как аналогичный твердофазный синтез, [c.368]

Удивительно простая идея этого нового метода синтеза состоит в том, что аминокислота закрепляется через свою карбоксильную группу на нерастворимом легко фильтруемом полимере, и затем пептидная цепь постепенно наращивается с С-конца. Для этой цели К-замещенные аминокислоты вводят в реакцию с реакционноспособными группами полимерной смолы. С аминокислоты, ковалентно соединенной с полимерной частицей, удаляется Ы-защитная группа, и полученный аминоацильный полимер реагирует со следующей Ы-защищенной аминокислотой. Пептидная цепь ступенчато наращивается на полимерной матрице. На последней стадии синтеза Меррифилда расщепляется ковалентная связь между С-концевой аминокислотой построенной полипептидной цепи и якорной группировкой полимерного носителя. Нерастворимый носитель может быть отделен от находящегося в растворе полипептида простым фильтрованием. Решающее преимущество метода Меррифилда состоит в том, что избегают трудоемких и требующих много времени операций по очистке промежуточных продуктов. Ценный продукт реакции все время остается прикрепленным к полимерному носителю, в то время как избытки реагентов и побочные продукты удаляются фильтрованием. Простота эксперимента и возможность автоматизации привели сначала даже к мнению, что благодаря этой новой синтетической концепции будет, наконец, решена проблема химического синтеза ферментов и других белков. Однако после подробного изучения и интенсивной разработки этой новой техники синтеза были выявлены серьезные лимитирующие факторы, которые впоследствии привели к реалистической Оценке этого метода. Конечно, сведение трудных стадий высаживания и очистки при обычных методах в растворе к простому процессу фильтрования в твердофазном синтезе уже означает неоспоримое преимущество. [c.179]

Уже в 1965 г. Шемякин и сотр. [471] предложили применять для пептидного синтеза жидкие полимерные носители, чтобы таким путем преодолеть некоторые недостатки твердофазного метода. В случае применения жидкого полимерного носителя реакция конденсации может проводиться в растворе. Правда, при этом отделение избыточных реагентов после каждой стадии конденсации возможно только с помощью сложной операции высаживания. Введением полиэтиленгликоля (ПЭГ) как С-концевой защитной группы растущей пептидной цепи и применением улбтрафильтрации для отдельных низкомолекулярных реагентов Муттер и сотр. [472] решающим образом улучшили жидкофазный метод. [c.195]

Весьма перспективным методом синтеза пептидов является твердофазный метод, заключающийся в присоединении карбоксильной группы аминокислоты к нерастворимому полимеру посредством сложноэфирной связи. Затем к первой аминокислоте присоединяют следующую, предварительно отщепив защитную группу В результате образуется дипептид, по-прежнему присоединенный к носителю. Такие циклы можно повторять многократно, получая полипептиды необходимой длины. [c.24]

В отличие от приведенного примера, когда на поверхности полимера была сначала зафиксирована Ы-защищенная С-концевая а-аминокисло-та, при твердофазном методе синтеза возможно также сначала нанести на поверхность полимера активированную Ы-концевую а-аминокислоту и вести процесс пептидного синтеза с последующими активированными а-аминокислотами. С помощью твердофазного метода синтеза на носителях в 1969 г. в течение нескольких недель удалось осуществить полный синтез фермента рибонуклеазы, насчитывающего 124 а-аминокислотных остатка. [c.655]

Удачный способ устранения потерь целевого продукта — присоединение растущей полипептидной цепи к полимерному носителю ковалентной связью, разрушаемой после окончания всего синтеза (твердофазный синтез Меррифилд, 1962). Так, хлорметилированный сополимер стирола с 1—2% дивинилбензола (см. Дивинилбензола сополимеры) в присутствии небольших количеств NaJ легко реагируют с солью триэтиламина и ациламинокислоты [c.16]

Однако отщепление пептида от носителя в этом случае возможно только с помощью НР. Что касается повышения выхода при твердофазном синтезе пептидов, то оказалось, что более длинные группировки между С-концевой аминокислотой и полимерным носителем оказывают положительное влияние, например [417] [c.184]

После п-кратного повторения реакционных стадий III и IV (рис. 2-12) желаемая пептидная последовательность строится на полимерном носителе на стадии V. Несмотря на указанные недостатки, твердофазный пептидный синтез открыл новые возможности для автоматизации. Первый аппарат был сконструирован Меррифилдом и сотр. [440] (рис. 2-20). [c.191]

Если проанализировать все проведенные синтезы Меррифилда (табл. 2-9), то станет ясно, что это в основном работы в период между 1968 и 1972 гг. В это время во многих новых лабораториях — а их количество в США со времени опубликования концепции Меррифилда увеличилось в десять раз — начали проводить синтезы пептидов на носителях, чему в значительной степени способствовала коммерческая доступность синтезаторов. Очевидно, разочаровывающие результаты при попытках синтеза белков привели к реалистической оценке возможностей метода. Попытка синтеза лизо-цима привела, например, к смеси полипептидов, которая обладала 0,5—1% специфической активности [455]. Гораздо успешнее был синтез рибонуклеазы А [449], хотя и в этом случае выход составлял всего 16%. На этом ферменте с помощью твердофазной техники проведено интересное изучение взаимосвязи строения и активности [467]. Несомненно, что биологическая активность не является критерием гладкого течения твердофазного синтеза. Синтез белка, состоящего из 188 аминокислот, который сначала считали гормоном роста человека, дал смесь белков с заметной биологической активностью. Несколько позднее было, однако, показано, что положенная в основу синтеза первичная структура не подтвердилась [453, 468]. Синтез длинноцепочечных пептидов и белков по методу Меррифилда в настоящее время и в обозримом будущем уже не может отвечать тем высоким требованиям, которые предъявляются к синтезу биологически активных соединений. [c.193]

Стандартность операций в твердофазном синтезе олигонуклеотидов явилась основой для автоматизации процесса. Принцип работы автомата-синтезатора основан на подаче в реактор с помощью насоса (под контролем микропроцессора) защищенных нуклеотидных компонентов реагентов и р-рителей по заданной программе в колонку, содержащую полимерный носитель с закрепленным на нем первым нуклеозидом. После окончания синтеза и отделения полностью защищенного олигонуклеотида от полимерного носителя проводят деблокирование, очистку и анализ синтезир. фрагментов ДНК. Так, с помощью гидрофосфорильного метода [c.300]

Химия люминофоров изучает твердофазные системы, один или несколько компонентов которых содержатся в малом количестве (10 — 1,0%). Особенность этого раздела химии твердого тела заключается в том, что в качестве компонентов системы рассматривают не только химические элементы или соединения, но также точечные дефекты кристаллической решетки (например, вакансии) и свободные носители тока (электроны и дырки). Концентрация дефектов и свободных носителей тока (особенно при высокой температуре, при которой происходит синтез люминофора) сравнима с содержанием примеси активатора в люминофоре. [c.29]

Подобная же твердофазная техника нашла еще более эффектное применение в синтезе полинуклеотидов [5h]. Не менее важно и то, что использование твердых носителей открыло ряд многообещающих стратегических возможностей в других областях органического синтеза [5ij]. Таким образом, успешное разрешение проблемы, первоначально представлявшейся частной и чисто технической, привело в конечном счете к результатам большой и общей синтетической значимости. [c.302]

Синтез пептидов на полимерном носителе, при этом растущая полипептидная цепь ковалентно присоединена к нерастворимому или растворимому полимеру и отделение ее от полимера осуществляется на завершающей стадии синтеза. При использовании нерастворимого носителя принято говорить о твердофазном синтезе, существующем в настоящее время в полностью автоматизированном варианте. Созданные для этих целей приборы получили название синтезаторов. В некоторых случаях оказывается целесообразным использовать жидкофазный синтез иа основе растворимых полимеров. [c.127]

Познание химического строения белков позволило решить вопрос о их синтезе. В этом отношении также достигнуты большие успехи. В настоящее время используют разработанный в начале 60-х годов твердофазный синтез. При этом первая аминокислота закрепляется на полимерном носителе (специальной полистирольной смоле) и к ней последовательно подшиваются все новые и новые аминокислоты. По окончании синтеза готовая полипептидная цепь снимается с носителя. Таким методом были синтезированы инсулин, рибонуклеаза, а за ними и многие другие белки. Для синтеза рибонуклеазы необходимо было осуществить более десяти тысяч отдельных операций. В настоящее время разработаны автоматы, осуществляющие все необходимые операции по заданной программе. [c.334]

В то же время в материалах с высокой концентрацией носителей заряда (металлах) отражение электромагнитного излучения значительно преобладает над рассеянием с выделением теплоты. Синтез твердофазных материалов с использованием СВЧ нагрева может проводиться с использованием в качестве исходных реагентов веществ с полупроводниковым или ионным типом проводимости либо солей, содержащих сольватные группы (как правило, воду). Причем при облучении кристаллогидратов легкоразла-гающихся солей (например, нитратов З -элементов) нагрев солевой смеси за счет ориентационных переходов молекул кристаллизационной воды может приводить к термолизу солей с образованием высокодефектных оксидных фаз, нагреваемых уже за счет наличия в них подвижных носителей заряда. Нахождение при микроволновом нагреве источников теплоты внутри реакционной смеси во многих случаях позволяет существенно сократить как время протекания реакции, так и энергоемкость процесса. [c.237]

При проведении процесса в растворе для отделения избытка реагентов от пептидилтиогидантоина и тиогидантоина от укороченного пептида обычно используют хроматографию на сефадексе. Эти разделения и лиофилизация фракций с колонки отнимают много времени. Твердофазный анализ исключает многие из этих проблем, но неудачный выбор (или предварительный синтез) активированного носителя и сложности присоединения пептида к носителю резко снижают шансы иа успех определения. Ниже приводится детальное описание методик. [c.502]

Последовательность расположения аминокислотных остатков в полипептидной цепи создает первичную структуру белка она установлена в настоящее время для ряда природных белков. Осуществлен и синтез ряда белков, например инсулина (51 аминокислота), рибонуклеазы (124 аминокислотных остатка). Синтезы подобного рода требуют последовательного осуществления сотен химических операций. Большую помощь оказывает при этом метод твердофазного синтеза, предложенный Мэрифильдом в 1963 г. полипептидная цепь постепенно наращивается на полимерном носителе (полисти-рольной смоле) и лишь после завершения синтеза снимается е носителя. [c.635]

Полимераналогичные реакции представляют интерес не только для получения новых полимеров или модификации полезных свойств полимеров, но они получают все возрастающее значение также и в области синтетической органической химии. Примерами могут служить получение и применение иолимериммобилизованных катализаторов и ферментов (на полимерных носителях), а также использование полимеров в твердофазном синтезе (см. раздел 3.3.1) и использование их в качестве полимерных реагентов [3.1.6]. [c.720]

Наряду с синтезом П. в р-рах, важное значение имеет синтез П. с применением нерастворимых носителей. Ов включает твердофазный синтез П. (р-ция или метод, Мэр-рифнлда) и. синтез П. с использованием полимерных реагенте .. [c.471]

Стратегия твердофазного пептидного синтеза предусматривает временное закрепление синтезируемой лептидной цени надераст римом полимерном носителе и осуществляется по схеме [c.471]

Нерастворимые полимерные эфиры являются чрезвычайно интересным классом карбоксизащитных групп, из которых полимерный беизиловый эфир является прототипом разработанного Меррифилдом твердофазного синтеза пептидов. Проблема синтеза на полимерных носителях излагается (разд. 2.2.7). [c.120]

Селективное отщепление №-замещенной группы (III, рис. 2-12) — следующая ступень синтеза Меррифилда.. Выбор N -аминозащитной группы зависит как от прочности связи между исходной аминокислотой и полимерным носителем, так и от защитных групп на функциях боковых цепей. Требования к защитным группам, применяемым в твердофазном синтезе, особенно велики в отношении селективности отщепления. [c.187]

Жидкофазный способ синтеза пептидов предусматривает использование в качестве носителей растворимых полимеров (М. М. Шемякин, 1965). Одним из недостатков твердофазного синтеза является изменение степени набухания полимера по мере роста пептидной цепи, которое может приводить к периодическому маскированию концевых NH2-гpyпп растущей пептидной цепи. Это, в свою очередь, вызывает неполное протекание реакций конденсации на той или иной стадии, и в результате образуются ложные пептиды , т. е. пептиды с пропуском отдельных аминокислотных остатков. Разделение смеси пептидов иа конечном этапе синтеза в этом случае оказывается затруднительным. При жидкофазном способе пептидного синтеза на полимере снимаются некоторые осложнения, вызываемые гетерогенностью среды. [c.147]

Франк и Хагенмейер [477] предложили вариант стратегии смешанного твердофазно-жидкофазного синтеза с применением полимерных носителей. При этом на каждой стадии возможно простое отделение как избытка аминокислоты, присоединяемой к растущей цепи, так и непрореагировавшей [c.197]

Под стратегией понимают последовательность соединения аминокислотных составляющих в пептид. С введением твердофазного синтеза в 1962 г. появился дополнительный выбор методов, т. е. кроме традиционного синтеза в растворе можно получать пептиды на второй фазе. При этом синтез на второй фазе может протекать либо как гетерогенная реакция (твердофазный синтез), либо как гомогенная реакция при применении растворимых полимерных носителей (жидкофазнкй синтез), либо как одновременно гетерогенная, так и гомогенная реакция (чередующийся твердо-фазно-жидкофазный синтез). В связи с этнм подятие стратегии несколько изменилось. Теперь под стратегией понимается только тип соединения аминокислот, причем различают ступенчатое наращивание цепей и фрагментную конденсацию. Особенности этих путей синтеза обсуждаются ниже. [c.211]

Эти трудности в значительной мере были преодолены при использовании твердофазного синтеза пептидов [Меррифилд Б., 1962]. В этом методе в отличие от классического синтеза используется твердый носитель (твердая фаза) в виде зерен полимерной смолы (диаметр 20—70 мкм), поверхность которых содержит хлорметильные—СНзС1 группы ( якорные группы) (рис. 11.3). [c.360]

Специфической особенностью полипептидного синтеза является огромное число идентичных стадий, которые необходимо проводить на каждом этапе удлинения цепи образование новой пептидной связи, удаление защитной группы для подготовки к следующей стадии элонгации цепи и промежуточные отмывки от избытка реагентов и, побочных продуктов после каждого химического превращения. Метод, предложенный Робертом Меррифилдом, дал возможность автоматизировать этот процесс и снизить механические потери. Согласно этому методу, первый мономер во вновь строящейся цепи синтезируемого полипептида ковалентно связывается с нерастворимым носителем (смолой) и все последующие стадии проводятся с полипептидом, растущим на этой смоле. Этот метод известен как твердофазный синтез полипептидов. К смоле попеременно добавляют очередной синтон и реагент для удаления концевой защитной группы, остаток). Химические стадии перемежаются соответствующими промывками. В течение всего процесса полипептид остается связанным со смолой. Поместив в колонку смолу, с которой связан синтезируемый пОлипептид, можно легко автоматизировать процесс, запрограммировав смену потоков через колонку синтон (мономер) — растворитель — смесь для удаления защиты — растворитель и т.д. Разработаны специальные приборы для автоматизированного полипептидного синтеза. Так, уже упоминавшийся синтез протеазы ВИЧ-1 провели на автоматическом пептидном синтезаторе <АррИе(1 Biosystem> и потребовалось около двух-10- 291 [c.291]

Оба метода легко автоматизируются в твердофазном варианте аналогично методу, предложенному для пептидного синтеза Меррифилдом. Более того, фос-фитв 1Я химия вообще чрезвычайно редко применяется в ясидкофазном варианте. В качестве носителя используют главным образом силикагель или пористое стекло. Их обрабатывают так, чтобы ввести аминогруппы, которые в дальнейшем [c.297]

Синтез на полимерном носителе. Пептидный синтез в классическом варианте сопряжен со значительными затратами труда и времени. С целью создания более эффективной методологии Р. Меррифилд в 1963 г. предложил твердофазный метод синтеза пептидов. Идея его состоит в закреплении растущей полипептидной цепи на полимерном нерастворимом носителе. При этом значительно упрощаются операции выделения промежуточных продуктов, которые сводятся к экстракции и фильтрованию полимера, полностью снимается проблема нерастворимости пептидов и создаются предпосылки для автоматизвции процесса. Определяющим фактором в твердофазном синтезе является полнота протекания всех химических реакций, которая достигается за счет применения избытка конденсирующего агента и N-зaщищeннoй аминокислоты, отделяемых экстракцией. Естественно, выбор защитнык группировок и методов конденсации должен обеспечить полное отсутствие рацемизации. Наилучшие результаты достигаются при использовании [c.145]

В последние годы создан колоночный вариант твердофазного сиитеза пептидов. В качестве матрицы вначале использовалась полярная полиамидная смола. Этот желатинообразный полимер хорошо проницаем и сольватируется многими растворителями, включая воду и диметилформамид. Мягкие полимеры такого типа в колоночном варианте имели неудовлетворительные физико-химические и механические свойства. Р. Шеппард и сотр. пред.южнли использовать жесткий макропористый неорганический носитель — силикагель, в порах которого заполимеризован полидиметилакрил-амидный гель. Этот носитель, сочетающий в се е свойства жесткой матрицы и хорощо набухающего органического геля, нашел успешное применение в ко.аоночном твердофазном синтезе. На его основе создан и синтезатор колоночного типа. [c.147]

Для осуществления таким способом синтеза достаточно длинных полимеров необходимы высокие выходы на каждой стадии конденсации. Существенным фактором успеха при твердофазном синтезе является также качество полимерного носителя, который должен быть инертным, содержать стерически доступные функциональные группы Д.1Я присоединения первого звена, иметь достаточный размер пор, чтобы обеспечить свободную диффузию реагентов, и, наконец, неспецифически не связывать реагенты и продукты. [c.365]

Очень перспективный метод синтеза пептидных связей предложил в 1960 г. Мерифильд (США). Этот метод потом получил название твердофазного синтеза пептидов. Первая аминокислота с защищенной аминогруппой присоединяется к твердому носителю — ионообменной смоле, содержащей первоначально группы — H l (1-я стадия с образованием так называемой якорной связи обозначена жирной линией) [c.385]

В случае реакции 1 энзим или катализатор ковалентно связан с полимером. Хорошо известно, что ионообменные полимеры с кислотными группами широко используют в качестве гетерогенных катализаторов. В качестве примеров можно привести кислотно-каталитические реакции фенола с ацетоном с образованием 4,4 -ди-гидроксидифенил-2,2 -пропана (бисфенола А) или алкилирование фенола олефинами. В реакциях типа 2 происходит взаимодействие низкомолекулярного соединения с полимером, содержащим функциональные группы, с переходом функциональной группы или электронов (редокс-полимеры). В случае твердофазного синтеза по Мерифилду [5, 6] имеет место ступенчатое образование поли-пептидных последовательностей с помощью реакционноспособных полимерных носителей. В конце реакции основная полимерная цепь разрывается. В случае длинных полипептидных цепей вследствие неколичественного взаимодействия/ возникает разнозвенность, которая приводит к необходимости искать другие пути синтеза с применением защитных групп. Развивается направление, связанное с использованием растворимых носителей [7]. Метод Мерифилда применяют ограниченно. В последние годы, правда, твердофазный синтез снова приобрел значение для получения олигонуклеотидов, так как он включает небольшое число стадий [8]. В качестве полимерных носителей используют наряду с кремниевым гелем полистирол [9—11] и гидрофильные набухающие полимеры [12, 13]. [c.79]