Разделение смеси аминокислот на ионообменных смолах

После полного гидролиза белка производится количественное онределе-ние каждой из аминокислот, присутствующих в гидролизате. Для разделения аминокислот чаще всего применяется метод ионообменной хроматографии. В качестве ионообменника обычно используют сульфополистирольный катионит. Смесь аминокислот вносится в верхнюю часть колонки при pH 3 в этих условиях индивидуальные аминокислоты полонштельно заряжены. Аминокислоты в форме катионов сорбируются на сульфополистирольной смоле (содержащей группы — SOg Na ), замещая часть ионов натрия, и удернги-ваются на материале колонки электростатическими силами. Очевидно, что прочность сорбции аминокислоты возрастает с увеличением ее основности. После внесения смеси начинается элюция аминокислот при постепенном увеличении pH и 1тонной силы буферных растворов, пропускаемых через колонку. В этих условиях положительный заряд на аминокислотах постепенно нейтрализуется и ионные взаимодействия ослабляются. Первыми с колонки снимаются кислые аминокислоты (глутаминовая и аспарагиновая кислота), затем нейтральные и, наконец, основные. С помощью этого метода можно разделять все аминокислоты, обычно встречающиеся в белках, поскольку прочность сорбции аминокислоты смолой зависит как от ионных, так и от неионных взаимодействий. Сульфополистирольный катион адсорбирует аминокислоты достаточно избирательно, так что все нейтральные аминокислоты, которые нельзя разделить с помощью ионного обмена, тем не менее элюируются с колонки в разных фракциях. Индивидуальные аминокислоты, элюируемые с колонки, собираются автоматическим коллектором фракций. Затем их количественно определяют путем измерения интенсивности окраски, возникающей при действии нингидрина. В настоящее время промышленность выпускает несколько типов автоматических амино- [c.57]

Разделить с помощью одной лишь хроматографии эту сложную смесь продуктов частичного расщепления цепи — аминокислот, дипептидов, трипептидов, тетрапептидов и т. д. — было очень трудно. Зангер и Туппи применили другие методы разделения (электрофорез и адсорбцию на угле и на ионообменных смолах), с помощью которых они разделили пептидные обломки на группы. Теперь они подвергали анализу уже эти более простые смеси с помощью хроматографии на бумаге. Им удалось выделить из разрушенной цепи 22 дипептида, 14 трипептидов и 12 более крупных обломков (см. фиг. , А). Хотя эти вещества были получены лишь в микроскопических количествах, тем не менее специальными методами они были идентифицированы и была установлена последовательность расположения образующих их аминокислот. [c.97]

Ионообменную хроматографию широко используют и для разделения неорганических соединений, а в органической химии — для разделения смесей кислот или оснований. Классическим примером является разделение смесей аминокислот, образующихся при гидролизе пептидов и белков [43]. Пептиды, белки и ферменты, содержащие кислотные и (или) основные группировки, также могут быть разделены с помощью ионообменной хроматографии. Интересные возможности открываются при использовании сильноосновных смол в бисульфитной форме [44]. Когда смесь альдегидов и кетонов пропускают через такую смолу, они обратимо связываются со смолой в виде бисульфитных комплексов это позволяет разделить компоненты смеси. [c.321]

РИС. 8.4. Разделение аминокислот ионообменной хроматографией п одноколоночной системе. Колонка (6X460 мм), заполненная смолой типа W-3 до высоты 220 мм. Натрийцитратные буферы pH 3,25 (0,2 М Na+, с 17о-ным пропапо-лом-2 pH 3,95 (0,4 М Na+) pH 6,4 (1,0 М Na+). Температура 50-60 °С. Скорость потока 44 мл/ч (буфер), 22 мл/ч (нингидрин). Кювета 12 мм. Вся шкала 2,0 Л. Смесь аминокислот для построения градуировочного графика (50 нмоль каждого компонента в 100 мкл). С разрешения фирмы Be kman. [c.276]

V Ионообменный метод разделения веществ в динамических условиях осуществляется по одному из двух основных видов хроматографического процесса. Для разделения веществ с целью анализа обычно смесь веществ сорбируют в верхней части колонки и элюируют раствором электролита. В процессе медленного перемещения компонентов вдоль колонки происходит разделение смеси веществ. При такой постановке опыта концентрация разделяемых веществ в растворе внутри колонки бывает незначительна, и в зоне каждого из разделяемых компонентов содержится большое число ионов элюента. Так, например, при хроматографическом разделении аминокислот на катионообменных смолах в зоне каждой аминокислоты содержится значительно большее но сравнению с аминокислотой число ионов натрия или аммоиия. Подобный метод разделения ионов резко отличается от препаративных ионообменных методов разделения веществ, при которых в результате сорбции большая часть ионогенных групп ионита оказывается связанной с избирательно поглощаемыми ионами. Процесс вытеснения ионов в последнем случае приводит к получению высококонцентрированных элюатов выделяемых веществ. [c.242]

При перегруппировке смеси стереоизомерных оксимов или оксимов, устойчивых в щелочной среде, получается, как правило, смесь изомерных замещенных амидов. В этом случае разделению обычно подвергают не сами замещенные амиды, а продукты их гидролиза, который производят продолжительным кипячением смеси амидов с 20%-ной серной кислотой или с разбавленной соляной кислотой. Аминокислоты, получающиеся при гидролизе лактамов, могут быть выделены по одному из описанных спосо-бов232, 333 например добавлением карбоната бария (в том случае, если гидролиз лактяма призводился нагреванием с разбавленной серной кислотой) или с помощью ионообменных смол б9 [c.166]

В результате расщепления белка или полипептида, каким бы методом оно ни осуществлялось, всегда образуется смесь пептидов. В среднем наиболее короткие пептиды получают при химотрипсиновом гидролизе, а наиболее длинные — при обработке бромистым цианом (так как содержание метионина в большинстве белков очень мало по сравнению с суммарным содержанием крупных гидрофобных аминокислот). При фракционировании смесей пептидов наилучшие результаты дает метод ионообменной хроматографии на колонках. Если для разделения используют смолу дауэкс I или другую, сходную смолу основного характера, а для элюции — ниридин-ацетатный буфер с постепенно понижающимся значением pH (8—3), то первыми с колонки выходят основные пептиды наиболее кислые выходят последними (фиг. 12). Обратный порядок элюции имеет место при [c.72]

В альтернативном варианте энантиомерного анализа с ка-тионообмениой смолы собирают каждую из аминокислот по отдельности в летучем буфере (0,1 М пиридин — ацетат, pH 3,1 затем 0,4 М пиридин — ацетат, pH 5,3) с последующим разделением на изомеры на обращенной фазе с хиральной добавкой (Engel, 1981, частное сообщение). В тех случаях, когда смесь содержит не все белковые аминокислоты, стадия ионообменной хроматографии может быть опущена. [c.341]