Центрифугирование в градиенте плотности нуклеиновых кислот

Метризамид имеет определенные преимущества перед сахарозой в отношении плотности и вязкости его растворов. При одинаковой концентрации вязкость раствора метризамида несколько меньше, чем раствора сахарозы, а плотность — существенно выше. Это означает, что для создания устойчивых градиентов плотности растворов метризамида требуются заметно меньшие его концентрации. И все же метризамид практически почти не используют для зонально-скоростного центрифугирования, что объясняется рядом причин. Одна из них, как будет видно ниже,— очень низкие значения плавучих плотностей нуклеиновых кислот в его растворах и, следовательно, малые скорости осаждения [c.209]

Фракционирование белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы основано на различии в скорости седиментации молекул, пропорциональной их молекулярной массе. Фракции РНК, обладающие различной молекулярной массой, после центрифугирования распределяются в линейном градиенте концентрации сахарозы при этом благодаря значительной вязкости растворов сахарозы улучшается разделение и уменьшается возможность смешивания различных фракций. [c.172]

В этом варианте препарат в виде тонкого слоя помещают в пробирку поверх среды, плотность которой обычно меньше плотности выделяемых частиц, и затем подвергают центрифугированию. Под действием приложенной центробежной силы частицы движутся в виде отдельной полосы через градиент, который служит лишь для того, чтобы предотвратить размывание зоны, или полосы в результате конвекции. Этот исключительно полезный метод, очень широко применяемый как для аналитических, так и для препаративных целей, используется для выделения и характеристики частиц всех размеров, начиная от таких крупных объектов, как вирусы, ядра и митохондрии, и кончая рибосомами, а также чистыми белками и нуклеиновыми кислотами. [c.250]

ДНК ядер и хлоропластов отличаются не только по нуклеотидному составу. Удалось зарегистрировать различия в плотности этих двух видов ДНК, используя центрифугирование нуклеиновых кислот в градиенте плотности хлористого цезия. Если центрифугировать ДНК, извлеченную из целых листьев, т. е. в основном ядерную, то основной пик плотности будет соответствовать 1,689 (фиг. 24). ДНК, выделенная из тщательно очищенных хлоропластов, имеет основной пик плотности 1,697. [c.65]

В последнее время разработан метод центрифугирования в градиенте плотности, с успехом использованный для разделения нуклеиновых кислот. По этому методу центрифугируют смешанный раствор высокомолекулярного и низкомолекулярного веществ. При больших угловых скоростях вследствие седиментации низкомолекулярного вещества на разных уровнях устанавливаются различные плотности раствора. Если молекулы высокомолекулярного соединения находятся в точках с плотностью раствора, большей их собственной плотности, то они перемещаются к оси вра- [c.49]

Этот метод нашел особенно широкое применение при разделении вирусов с различным содержанием нуклеиновых кислот, а также при изучении свойств нуклеиновых кислот (см. гл. IV, разд. В). Центрифугирование В градиенте плотности оказалось весьма ценным методом очистки и разделения некоторых вирусов. [c.37]

Пожалуй, наиболее полной экстракции рибосомных белков можно добиться путем разрушения структуры рибосом под действием ДСН [1375]. В этом случае рибосомные белки образуют комплексы с ДСН, которые можно подвергать электрофорезу в ДСН-содержащих гелях без предварительного удаления нуклеиновых кислот. В практическом отношении применение ДСН очень удобно, поскольку это позволяет анализировать небольшие количества рибосом или рибосомных субчастиц. Так, например, из фракций, полученных при центрифугировании в градиенте плотности, можно выделить рибосомные субчастицы путем осаждения ТХУ. Осадки после нейтрализации растворяют в буфере, содержащем ДСН [599], и белки разделяют электрофорезом в соответствии с их молекулярными массами. [c.310]

Равновесное центрифугирование в градиенте плотности в ряде случаев применяли при работе с белками, но ббльшая часть полученных данных относится к нуклеиновым кислотам. В гл. 22 приведены примеры применения этого метода. [c.265]

С помощью предложенных выше подходов проанализируем несколько описанных в литературе примеров использования зонально-скоростного центрифугирования в градиентах сахарозы с точки зрения выбора режима. Одновременно составим представление о порядках значений скорости и продолжительности центрифугирования в наиболее типичных случаях фракционирования белков и нуклеиновых кислот. Примем следующие приблизительные значения плавучей плотности (р, г/см ) для белков 1,3 для ДНИ 1,35 для ДНК и РНП 1,4 для РНК 1,5. [c.232]

В случае смеси макромолекул с различными значениями 5 при относительно высокой концентрации возникает особая проблема. В этом случае молекулы мешают седиментации не только себе подобных, но и других типов молекул. К тому же молекула с большим S и большей концентрационной зависимостью, должна седиментировать через раствор более медленно движущихся молекул. При высокой концентрации более быстро осаждаемые молекулы будут так задерживаться, что они седиментируют почти с той же скоростью, что и более медленно осаждаемые молекулы при этом может происходить маскировка того факта, что в действительности имеется смесь, и можно получить ошибочную информацию о гомогенности материала. Этот процесс носит название эффекта Джонстона — Огстона. На деле для разделения больших молекул нуклеиновых кислот часто приходится работать с очень низкими концентрациями, поскольку только в этих условиях происходит разделение двух компонентов. Однако даже при этих концентрациях полученные данные показывают меньшее содержание более быстро осаждаемого компонента, чем имеется в действительности. Пример этого дан на рис. 11-14. Как будет показано ниже (см. разд. Зональное центрифугирование в предварительно подготовленном градиенте плотности ), эта трудность сводится к минимуму при использовании метода зонального центрифугирования. [c.294]

Фиколл и перколл явно непригодны для зонально-скоростного центрифугирования белков и нуклеиновых кислот. При тех ко 1центрациях, которые необходимы для обеспечения устойчивости градиента плотности, вязкость их растворов слишком высока. [c.209]

При центрифугировании денатурированной ДНК или однонитевых РНК бывает необходимо предотвратить их реассоциацию и агрегацию за счет образования случайных водородных связей между основаниями. Для ДНК это осуществляют подщелачива-нием раствора NaOH (до 0,1 М). В случае РНК щелочь непригодна (гидролиз ), но можно создать градиент плотности растворением сахарозы не в воде, а в концентрированных растворах формамида или диметилсульфоксида (ДМСО), иногда даже в 100%-ном формамиде или ДМСО, Полученные градиенты называют денатурирующими градиентами сахарозы . Следует помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через кожу, поэтому работать необходимо в перчатках. Кроме того, ДМСО разрушает нитроцеллюлозные и поликарбонатные пробирки. Из него необходимо удалять следы тяжелых металлов перемешиванием в течение 1,5 ч с 3%-ной суспензией бифункциональной ионообменной смолы. Перед нанесением на градиент препараты нуклеиновых кислот целесообразно прогревать в течение 2— 3 мин при 80 для разрушения уже образовавшихся агрегатов. [c.212]

Денатурация нуклеиновых кислот сводится к разрушению двойной спирали (ДНК) илп двуспиральных участков (РНК). Нагревание раствора нативной ДНК вызывает разделение двойной спиралп па две цени, сворачивающиеся в статистические клубки, Нри этом значительно уменьшаются вязкость и оптическая активность, исчезает гипохромизм, т. е. возрастает интенсивность поглощения в области 260 нлг. Разделение на две цепи непосредственно доказывается центрифугированием ДНК, содержащей N, в градиенте плотности s l (ср. с. 82). Клетки Е. сой, выращенные в среде, содержащей i, переносились в среду с обычным N. При делении клеток образовывались редуплицированные двойные спирали, в которых одна цепь содержала N, другая — N. До денатурации наблюдался один пик плотности 1,717 г/см отвечающий двойным спиралям N — N. После денатурации появляются два пика — 1,740 и 1,724 г/см , отвечающие одноиптчатым клубкам соответственно с и., с 4, Плотность повышается, так как клубки более компактны, чем спираль. М. м. ДНК уменьшается при денатурации вдвое. Образование клубков наблюдается в электронном микроскопе. [c.233]

Используя соответствующую соль, можно создать устойчивый в условиях центрифугирования градиент ее концентрации, а тем самым и градиент плотности растворителя. Если природа соли и распределение ее концентрации таковы, что плавучая плотность биополимера выше, чем плотность растворителя на мениске, но ниже, чем у дна пробирки, то по мере перемещения к дну пробирки биополимер достигнет участка, где множитель 1 - / о/р станет равным нулю и дальнейшая седиментация прекратится, т.е. возникнет устойчивая зона нахождения биополимера. Наиболее широкое применение для этой цели нашли растворы солей цезия, которые позволяют получить растворы с плотностью, достаточной для остановки перемещения нуклеиновых кислот. Эксперименты подобного рода весьма дороги, так как требуют длительной, обычно на протяжении нескольких суток, работы ультрацентрифуг. Однако они открывают некоторые уникальные возможности. Например, удается разделить биополимеры, различающиеся лишь изотопным составом. Молекулы ДНК из одного вида микроорганизма, выращенные на средах, содержащих в качестве источника азота соли аммония и 15NH4, не отличаются по объему, но имеют разные массы и, следовательно, различные плавучие плотности. Поэтому при равновесном центрифугировании и градиенте плотности хлорида цезия они образуют отдельные зоны. Пример применения этого метода для доказательства полуконсервативного характера репликации ДНК приведен в 5.1. [c.244]

Метод центрифугирования в градиенте плотности был изобретен впервые Линдерштрём-Лангом. К изучению нуклеиновых кислот в водных растворах его с успехом применили Месельсоп, Сталь и Виноград [26]. Для линейных полимеров в органических растворителях его впервые разработали Бреслер, Нырков и [c.171]

Особым случаем равновесного центрифугирования является седиментация при градиенте плотности [14, 76, 135], для которой применяют двухкомпонентные системы растворителей. Градиент плотности возникает вследствие седиментационного разделения составных частей растворителя вещества с различной плотностью распределяются в различных точках, где их эффективная плотность равна плотности окружающей среды. Вследствие диффузии в этих полосах накопления зависимость с от г в идеальном случае подчиняется закону Гаусса. Чаще всего этот метод применяли для исследования нуклеиновых кислот, но можно получить распределение в градиенте плотности и для полимеров умеренного молекулярного веса, если в качестве растворителей брать смеси 1,2-дибром-1,2-дифторэтана с циклогексаном и использовать оптическую шлирен-систему [221. Другая система описана Бреслером и сотр. [30]. Сведения о распределении сополимеров по составу можно получить также путем измерения рассеяния света[33]. [c.61]

Из других тканей ядра иногда выделяют следующим образом хорошо размельченную ткань обрабатывают слабой кислотой, например лимонной, затем подвергают дифференциальному центрифугированию и осадок промывают очень разбавленной кис.по-той (фото 2). Напомним, что Мишер изолировал ядра из клеток гноя, пользуясь для этого разбавленной уксусной кислотой. Существует еще и метод с использованием лимонно кислоты, развитый и улучшенный Даунсом [142, 143], а также Мирским и Поллистером ]144], в чьих работах и можно найти его подробное описание. Изолировав при помощи лимонной кислоты ядра при различных значениях pH, Даунс [142] установил, что ядра, полученные при pH значительно ниже 3,0, несомненно, теряют большую часть содержащегося в них гистона. Поэтому при анализе всей такой ядерной массы данные о содержании нуклеиновых кислот и липидов бывают завышенными. Ядра же, изолированные при pH 6,0—6,2, оказываются лишенными некоторого количества нуклеиновой кислоты и, но-видимому, белков. В большинстве случаев для получения изолированных ядер, свободных от цитоплазматических остатков, применяют повторное промывание ядерной фракции разбавленным раствором хлористого натрия или лимонной кислоты. Не удивительно поэтому, что, как показали Мирский и его сотрудники [224], химическое определение белка всей массы изолированных таким путем ядер дает значительно более низкие величины, чем анализ ядер, выделенных в безводной среде. Впервые выделение ядер в безводной среде было осуществлено Беренсом [145]. Измельченную и лиофили-зированную ткань подвергали седиментации в колонках с градиентом плотности органических растворителей. В дальнейшем этот метод был модифицирован и улучшен [144—147]. Преимуще- [c.136]

Для определения молекулярного веса ДНК (обзоры — см. наиболее широко используются методы, основанные на определении скорости седиментации макромолекул. Это определение может быть выполнено по различным методикам наиболее широкое распространение в последнее время приобрела методика, основанная на зональном центрифугировании в градиенте плотности сахарозы в препаративной ультрацентрифуге В данном случае распределение веществ по скорости осаждения можно контролировать по радиоактивной метке, что обеспечивает высокую чувствительность с другой стороны, методика практически без изменений может быть применена и для препаративного разделения нуклеиновых кислот. Предложен ряд эмпирических уравнений, связывающих скорость седиментации двухцепочечного комплекса ДНК со значением молекулярного веса определенным независимыми методами. Последнее из этих уравнений охватывает пределы мол. веса 0,2— 130 108. [c.30]

Центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия риоосом нормальных и зараженных фагом бактерий, а также постинфекционной РНК, синтез которой индуцируется фагом. Светлые кружки — оптическая плотность при 254 нм (т. е. общее содержание нуклеиновой кислоты), темные кружки — радиоактивность (т. е. содержание меченой РНК) в каплях, собранных через отвсрстне [c.392]

Большую ценность для изучения нуклеиновых кислот представляет метод центрифугирования в градиенте плотности s l и других аналогичных солей (т. е. со.лей, [c.59]

Было проведено сравнительное изучение седиментационных свойств РНК вируса саркомы Рауса и седимеп-тационных свойств РНК других вирусов. Наряду с центрифугированием в градиенте плотности глицерина после обработки диметилсульфоксидом или после нагревания была использована и новая методика — непосредственная обработка 99%-ным раствором диметилсульфоксида, которая гарантирует полную денатурацию нуклеиновых кислот и, таким образом, дает возможность выявить такие разрывы цепей и более длинные пропуски которые [c.114]

Разработаны методы выделения ядерной ДНК из каллуса, листьев, протопластов и отдельных клеток. В каждой лаборатории используют определенные варианты методик, которые обычно -подразумевают разрушение свежего растительного материала, удаление неразрушенной ткани фильтрованием, фракционирование клеточных компонентов дифференциальным центрифугированием, обработку ядер ДНКазой, лизис, депротеинизацию и последующую очистку нуклеиновых кислот в градиенте плотности s l/БЭ [6, 16]. В данном разделе изложены методики, которые можно взять за основу при разработке способов выделения ядерной ДНК из различного растительного материала. Кроме того, ядра, выделенные, как указано ниже, могут исполь- [c.254]

Рис. 64. Сопоставление картин распределения разных классов нуклеиновых кислот при одинаковых режимах центрифугирования в равновесных градиентах плотности растворов различных солей [Birnie, 1978]

В рассматриваемом случае центрифугирование проводили в роторе MSE 10X10 Т1 при частоте вращения 45 тыс. об/мин и 25° в течение 68 ч. Вносили по 4,6 мл исходного раствора соли, содержащего 5—10 мкг меченной по Н смеси нуклеиновых кислот. Начальные плотности солевых растворов ро были выбраны так, чтобы в каждом случае разделить максимальное число различных классов нуклеиновых кислот. Например, для градиента sjSOi оно равно четырем от нативной ДНК до РНК. При центрифугировании в градиентах s l и Nal РНК оказывается в осадке на дне пробирки. Любопытно различие в относительном расположении пика гибрида ДНК —РНК для градиентов растворов солей цезия и Nal. Можно предполо- [c.248]

Центрифугирование препаратов нуклеиновых кислот в градиенте плотности сахарозы используют в основном в двух целях фракционирование ио молекулярному весу (аналитическое и нренаративное) и определение коэффициента седиментации и молекулярного веса. Обычно применяют 5—20%-ный или 15—30%-ный линейный градиент плотности сахарозы [c.177]

Смотреть страницы где упоминается термин Центрифугирование в градиенте плотности нуклеиновых кислот: [c.235] [c.32] [c.596] [c.37] [c.29] [c.168] [c.389] [c.60] [c.109] [c.211] [c.204] [c.248] [c.217] [c.7] [c.59] [c.139] [c.181] [c.15]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология