Электрофорез в полиакриламидном принцип метода

Рис. 9-9. Замедление в геле. Принцип метода схематически изображен на рис. 9-9, А. Экстракт, полученный из линии клеток, продуцирующих антитела, смешивают с радиоактивными фрагментами ДНК, содержащими последовательность от точки—131 до + 36 (относительно сайта инициации транскрипции в положении +1) гена, кодирующего легкую цепь соответствующей молекулы антитела. Воздействие белков, входящих в состав экстракта, на подвижность фрагмента ДНК определяют методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей радиоавтографией. Свободные фрагменты ДНК быстро передвигаются к концу геля, тогда как фрагменты, связанные с белком, задерживаются. Обнаружение шести зон с замедленным движением указывает на присутствие в экстракте шести различных сайт-специфических ДНК-связывающих белков (обозначенных С1-С6). На схеме Б экстракты фракционировали с помощью стандартной хроматографической методики, каждую фракцию смешивали с радиоактивным фрагментом ДНК, наносили на одну дорожку полиакриламидного геля и анализировали далее, как

Зоны можно также сфокусировать в результате наложения молекулярно-ситового эффекта, например, если электрофорез ведется в полиакриламидном геле, то в результате влияния градиента плотности. При проведении электрофореза биополимеров все чаще используются принципы аффинности и иммунной преципитации. Контролировать ход электромиграционного разделения с высоким разрешением удобно с помощью метода двумерного электрофореза и иммунной преципитации. [c.283]

Подобно аффинной хроматографии, аффинный электрофорез в геле можно применять для определения констант диссоциации комплексов белок — лиганд. Принцип метода заключается в изучении зависимости подвижности данного белка от концентрации связанного лиганда в геле. Этот лиганд может быть либо ковалентно связан с гелем, либо только включен в гель (последнее обусловлено высокомолекулярными свойствами лиганда). Впервые такое использование электрофореза описано Такео и Накамурой [50], (хотя в этой работе еще не введен термин аффинный электрофорез ) константы диссоциации комплексов фосфорилаза— полисахарид определены с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем различные концентрации ковалентно связанного полисахарида. Бег-Хансен [9] применил электрофорез на сефарозе с ковалентно связанным конканавалином А для определения констант диссоциации комплексов конканавалина А с сывороточными гликоиротеинами. [c.168]

Аффинный электрофорез в полиакриламидном геле — это метод разделения, использующий преимущества и аффинной хроматографии, и электрофореза в иолиакриламидном геле [23, 24]. В микромасштабе он позволяет быстро анализировать смеси белков с избирательным разделением тех компонентов, которые обладают связывающими участками, комплементарными к иммобилизованным специфическим аффинным лигандам. Последние ковалентно связаны с частью матрицы полиакриламидного геля и образуют, таким образом, слой аффинного геля . Принцип этого метода хорошо иллюстрируется на типичном примере разделения активных белков аффинным электрофорезом, как показано на рис. 7.4. В стеклянных трубках равного диаметра готовят [c.166]

И Орнштейном [73]. Метод дискретного электрофореза, описанный этими авторами, или метод так называемого многофазного [48] зонного электрофореза в полиакриламидном геле, предусматривает объединение двух основных принципов электромиграции. На начальной стадии разделения происходит процесс фокусирования, сходный с изотахофорезом (см. разд. 12.3), который постепенно трансформируется в процесс зонного элек- [c.301]

Изоэлектрическое фокусирование обладает наивысшей разрешающей способностью, когда-либо достигавшейся при разделении белков цо зар5 дам [58—64, 92]. Этот метод позволяет разделить белки, велйчины р/ которых различаются всего на 0,01 ед. pH. Иногда Для такого разделения бывает достаточно различия между двумя структурами на одну заряженную группу. При помощи метода изоэлектрофокусирования можно также обнаружить другй различия в зарядах, которые, строго говоря, не связаны с макроскопической егомогенностью белков. Вот некоторые из факторов, обусловливающих такие различия посттрансляционная модификация первичной структуры (например, дезамидирование), связывание лигандов, химическая модификация, вариации в небелковых компонентах, например липидах, углеводах и других простетических группах, ассоциация и диссоциация, изменения окислительно-восстановительного состояния металлоферментов. Если при анализе картины изоэлектрофокусирования иметь в виду эти факторы, то полученные данные могут приобрести дополнительную ценность, поскольку в принципе они позволяют обнаружить микрогетерогенность белковых структур. В настоящее время метод изоэлектрического фокусирования применяют в сочетании с другими электрофоретическими методами, например в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, для получения двумерных карт разделяемых компонентов. В одном направлении производят разделение белков в соответствии со значениями их рД а в другом — в соответствии с размерами их молекул, т. е. в соответствии с их молекулярными массами. При помощи этих методов можно охарактеризовать смеси, содержащие тысячи белков [94]. Еще несколько лет тому назад разделение с таким высоким разрешением было просто немыслимо, а в настоящее время этот метод анализа находит все более широкое и все более успешное применение в различных биохимических исследованиях. [c.126]

Как уже отмечалось, качество разделения при проведении электрофореза в градиенте плотности сахарозы зависит от толщины стартовой зоны, которая в свою очередь определяется конструкцией аппарата и способом введения пробы. Однако даже в идеальных условиях стартовая зона, как правило, составляет несколько миллиметров, и в целях повышения разрешающей силы электрофореза ее желательно уменьшить. Принцип диск-электрофореза в полиакриламидном геле позволяет создавать очень тонкие стартовые зоны путем концентрирования белков, находящихся в исследуемом растворе. Именно поэтому он дает более эффективное разделение по сравнению с зональным электрофорезом в градиенте плотности. С другой стороны, извлечение белков из узких зон в полиакриламидном геле сложнее, чем из растворов с градиентом плотности. Процедура, сочетающая преимущества обоих методов, позволяет получать узкие стартовые зоны и легко выделять разделившиеся вещества из градиента плотности. Шастер и Шрир [1150] описали очень простой прибор для практического воплощения этой идеи. Электрофорез проводили в U-образной трубке. В обоих ее коленах над колонкой с градиентом плотности помещали слой полиакриламидного геля. Зоны, разделенные в геле, мигрировали затем в градиент плотности, где расширялись не более чем в 2—3 раза по сравнению с их толщиной в геле. Эта установка отличается довольно большой емкостью за один прием авторам удалось разделить 50 мг бычьего сывороточного альбумина, и, по их мнению, емкость должна быть еще больше при разделении более сложной смеси белков. [c.32]

На практике чаще всего работают либо при постоянном напряжении, либо при ста-билизированном токе. В самом деле, если напряжение остается неиз меиным и сопротивление в кювете падает, то ток должен возрастать. Если же сохраняется на одном уровне ток, то уменьшение сопротивления неизбежно приведет к снижению напряжения. Аналогичные простые выводы на основе закона Ома можно легко сделать в каждом конкретном случае. Решение вопроса о том, удастся ли получить лучшие результаты при поддержании неизменным тока пли напряжения, зависит от выбранного метода электрофореза. Например, электрофорез на бумаге обычно проводят при постоянном напряжении, а диск-электрофорез в полиакриламидном геле —при постоянном токе. Очень простой руководящий принцип, хотя и не всегда верный, заключается в том, что в случае неоднородной буферной системы более высокого разрешения можно достигнуть при стабилизации тока. Вместо с тем если электрическое сопротивление в разделительной камере существенно возрастает во время опыта (как, скажем, при ИЭФ), то лучше прибегнуть к стабилизации напряжения. [c.179]

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия — это основная процедура во всех обсуждаемых ниже методах двумерного разделения. Описание прибора и основных принципов разделения было сделано ранее (Taka s, 1979). Ниже будет сказано лишь об особых деталях метода, которые применяются в нашей лаборатории и дополняют процедуру, описанную в упомянутой статье. [c.73]

Определение последовательности нуклеотидов рассмотренными выше методами предполагает разделение продуктов секвенирующих реакций (как полученных в ходе ферментативного секвенирования, так и в процессе химической деградации) с помощью высоковольтного секвенирующего электрофореза в полиакриламидном геле. Сразу следует отметить, что этот метод претерпел целый ряд всевозможных улучшений и модификаций, направленных, главным образом, на повышение его разрешающей способности, рассмотрение которых и будет основной темой данной главы, поскольку сам принцип электрофореза детально изложен во многих обзорах и целых книгах и рассматривать его здесь, видимо, будет излишним. [c.168]