Методы секвенирования ДНК

Рис. 5.3. Схема электрофореграммы, полученной с помощью химического метода секвенирования ДНК (первая снизу строка соответствует нуклеотиду на 5 -конце и является нуклеотидом Т на уровне первой дорожки. Для определения полной последовательности (отмечено пунктиром) проводят анализ послойно всех дорожек

В основе метода секвенирования ДНК, разработанного Сэнгером и соавт. [Sanger et al., 1977а], называемого также методом секвенирования путем терминации цепи, лежал принцип ферментативного построения комплементарной цепи ДНК по существующей одноцепочечной матрице при происходящем в разных местах цепи ДНК ингибировании ее дальнейшего роста. [c.46]

Хотя сам принцип специфической терминации, положенный в основу первоначального метода секвенирования ДНК с помопц.ю дидезок-ситерминаторов, остался неизменным, само секвенирование ДНК по Сэнгеру все же стало в значительной степени другим. Причем для описания всех этих последовательных усовершенствований одной главы оказалось недостаточно и, кроме главы 2, целиком посвященной этому методу, еще ряд глав (глава 3. ПЦР-секвенирование ДНК глава 9. Автоматическое секвенирование ДНК) имеют к ферментативному методу секвенирования ДНК самое непосредственное отношение. Разработки векторов для молекулярного клонирования и стратегий секвенирования (главы 7 и 8 соответственно) также в большей степени ориентированы на ферментативное секвенирование. В связи с разделением нами в главе 7 векторов для молекулярного клонирования на несколько поколений следует отметить, что оно, конечно же, условно хотя бы по той причине, что огромная группа специализированных векторов оказалась не включенной в приведенную схему. Подробное рассмотрение стратегий секвенирования объясняется тем, что именно от их выбора часто зависит общая производительность метода секвенирования ДНК. [c.10]

Рис. 4-67. Химический метод секвенирования ДНК. Процедура, описанная на рис. 4-66, выполняется одновременно для четырех одинаковых проб ДНК. При этом используют химические агенты, расщепляющие ДНК в первом случае по Т, во втором по С, в третьем по С и четвертом по А Полученные образцы подвергают электрофорезу на параллельных дорожках одного геля, как это указано на рис. 4-64, А. Анализируя результаты электрофореза, можно определить последовательность ДНК. Так, первая снизу полоса соответствует нуклеотиду, расположенному на 5 -конце. При этом определяют, на какой из дорожек расположена полоса, - в данном случае это Т. Для определения полной последовательности эту же процедуру выполняют на уровне второй, затем третьей полосы и так далее. В данном случае метод идеализирован на самом деле химическая

Секвенирование ДНК по Сэнгеру. Это наиболее употребительный метод секвенирования ДНК, поскольку по сравнению с химическим методом он позволяет анализировать более крупные фрагменты ДНК с меньшей вероятностью ошибки. Секвенируемую ДНК сначала клонируют в одноцепочечный бактериофаговый вектор, который может функционировать в Е. соН. Чаще всего используют фаг М13 и его производные [13]. Одноцепочечная ДНК взаимодействует как субстрат с ДНК-поли-меразой, которая точно копирует первую цепь. Однако если нормальный дезокси-нуклеозидфосфат заменить его аналогом-дидезоксинуклеозидфосфатом, то дальнейшее функционирование полимеразы прекращается и рост синтезируемой цепи останавливается. Для инициирования этого процесса используют химически синтезированный универсальный нуклеотидный праймер. Реакцию проводят в присутствии четырех аналогов dNTP, один из которых содержит метку Р. Исходно имеется четыре реакционные смеси, в каждой из которых понижена концентрация одного из аналогов меченого нуклеотида. Поэтому в результате реакции получаются смеси меченных радионуклидами фрагментов ДНК, один конец у которых одинаков, но при этом они имеют разную длину и разные основания на другом конце. После инкубации ДНК в каждой смеси превращается в одноцепочечную форму. Затем смеси подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле. Длину и последовательность фрагментов ДНК можно считывать непосредственно с гелевого слоя. Этот метод позволяет секвенировать в одной серии реакции от 250 до 500 пар оснований. Полученные данные часто анализируют с помощью компьютера. [c.95]

Поскольку оба классических метода секвенирования ДНК - путем химической деградации и ферментативным построением комплементарной цепи - в условиях специфической терминации требуют разделения меченых фрагментов ДНК, различающихся по длине на один нуклеотид, в полиакриламидном гель-электрофорезе высокого разрешения, то этому процессу, а также и радиоавтографии, и чтению нуклео- [c.10]

Далее проводили фосфорилирование всех олигонуклеотидов по 5 -концам радиоактивным фосфором за счет [7- PlATP с помощью Т4-полинуклеотидкпназы. Смесь меченых олигонуклеотидов разделяли электрофорезом в ПААГ, получая лестницу полос, как было описано при рассмотрении электрофореза [Остерман, 1981]. В отличие от методов секвенирования ДНК здесь каждой полоске ( перекладине лестницы ) соответствует фрагмент, укороченный точно на один нуклеотид по сравнению с фрагментом предыдущей полоски. Как и при секвенировании ДНК, меченые гидролизаты наносили в параллельные треки со сдвигом по времени в 4, 8 и И ч, а весь электрофорез проводили в течение 14 ч, с тем чтобы лучше разрешить разные по длине фрагментов участки лестницы . [c.508]

Практически параллельно с методом Максама — Гилберта был развит другой метод секвенирования ДНК, получивший по имени создавшего его автора название метод Сэнгера. Этот метод считается наиболее перспективным для исследования первичной структуры больших молекул нуклеиновых кислот, вплоть до ДНК хромосом человека. В бго основе лежит анализ структуры не самой нуклеиновой кислоты, а продукта, получаемого в ходе ее репликации с помощью ДНК- юлимеразы. Аналогично, используя обратную транскрипцию, с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы можно анализировать структуру молекул РНК. [c.281]

Определение нуклеотидной последовательности — секвенирова-ние. Методы, позволившие идентифицировать генетически важные участки ДНК, имели большое значение. Но они также способствовали разработке исключительно эффективных новых методов секвенирования ДНК и создания рекомбинантных молекул. Секвенирование позволяет доволь- [c.29]

Кроме метода химической модификации нуклеиновых кислот в настоящее время широко применяется метод секвенирования ДНК с помощью высокоспецифичных ферментов — рестриктаз — на отдельные фрагменты, а также использование ДНК- олгше/ азы — фермента синтеза ДНК in vivo (см. главы 11 и 19). [c.272]

В конце 70-х годов были разработаны методы для простого и быстрого определения последовательности нуклеотидов (секвенирования) любых очищенных фрагментов ДНК. Вслед за этим были определены полные последовательности нуклеотидов многих генов млекопитающих. включая гены, кодирующие гемоглобин, инсулин и цитохром с. Объем информации о последовательностях ДНК столь велик (многие миллионы нуклеотидов), что для хранения и анализа имеющихся данных необходимо использовать компьютеры. Секвенировано несколько протяженных последовательностей ДНК, содержащих более 10 пар нуклеотидов среди них полный геном вируса Эпщтейна-Барр (вызывающего у человека инфекционный мононуклеоз), а также полный геном хлоропластов растений. В настоящее время щироко используются два различных метода секвенирования ДНК принципы, лежащие в основе химического метода иллюстрированы рис. 4-66 и 4-67. ферментативный метод объясняется на рис. 4-68. [c.234]

Модификация метода секвенирования ДНК, представленная на рис. 4-66 и 4-67, может быть использована для выявления в ДНК последовательностей, опознаваемых ДНК-связывающими белками. Связывание этих белков с регуляторными участками ДНК (которые обычно локализованы вне кодирующих участков генов), по-видимому, играет важную роль в определении того - какие именно гены активны в данном типе клеток. Понимание функции этих белков чрезвычайно важно для идентификации специфических последовательностей, с которыми они связываются. Для выявления таких последовательностей обычно используют метод, именуемый ДНК-футпринтинг. Сперва очищенный фрагмент ДНК метят по одному концу Р и затем расщепляют с помощью нуклеазы или химического соединения, делающего случайные разрезы в двойной спирали ДНК. Фрагменты, которые образуются из меченой цепи, разделяют на геле и выявляют на радиоавтографе после этого сравнивают расположение полос ДНК. образуемых в присутствии и в отсутствие ДНК-связываюших белков. Если связывание произошло, нуклеотиды в сайте расщепления оказываются защищен- [c.235]

В общих чертах стратегия Сенгера сохранила свое значение и до наших дней, однако за истекшие десятилетия были разработаны два новых подхода, которые произвели революцию в определении первичной структуры полипептидов (белков). Первый подход основан на разработанной Эдманом в 1967 г. автоматической процедуре последовательного отщепления и идентификации N-кoнцeвыx аминокислотных остатков в виде их фенилтиогидантоиновых производных. Второй подход связан с методом, разработанным Сенгером и, независимо, Максамом и Гилбертом, позволяющим проводить быстрое и однозначное секвенирование гена, кодирующего рассматриваемый белок. Оптимальная стратегия состоит в одновременном использовании обоих подходов. Автоматическая деградация по Эдману, намного более быстрая по сравнению с первоначальным ручным методом Сенгера, тем не менее сильно уступает по скорости методам секвенирования ДНК и сопряжена с рядом трудностей. С другой стороны, секвенирование ДНК не всегда дает однозначную первичную структуру исследуемого белка. Главным [c.38]

Во многих современных книгах, посвященных секвенированию ДНК, методу секвенирования путем химической деградации по Макса-му-Гилберту обычно отводят последние главы. Однако на протяжении продолжительного времени он все же был для большинства лабораторий основным методом и уступил свои позиции лишь после разработки серии удобных одноцепочечных фаговых векторов, а также после применения в качестве ДНК-полимеразы модифицированной Т7 ДНК-полимеразы или секвеназы. При этом данный метод не изменился столь существенно по сравнению с ферментативным и его описание требует значительно меньше места. В связи с этим, на наш взгляд, более логично представить его в главе 1 - перед главами, посвященными ферментативному методу секвенирования ДНК, претерпевшему целый ряд всевозможных усовершенствований и улучшений и являющемуся в настоящее время основным. [c.10]

Ввиду большого объема информации анализ нуклеотидной последовательности ДНК уже давно немыслим без компьютера и без банков данных. Современный молекулярный биолог должен хорошо разбираться в возможностях, предоставляемых ему той или иной программой, а также уметь пользоваться для этих целей сетью Интернет, что кратко изложено в главе 10. Глава 11 посвящена грандиозным успехам всей молекулярной биологии в виде расшифровки первичных последовательностей геномов разных свободноживущих организмов. В ней приводятся сведения в этой области по состоянию на конец ноября 1998 г. Несколько отличающиеся от классического метода ферментативного секвенирования подходы описаны в главе 12. Некоторые из них обладают значительным потенциалом. Глава 13 посвящена еще одному способу секвенирования ДНК с помощью гибридизации, где вклад отечественных ученых во главе с академиком А.Д. Мирзабековым особенно значителен. В заключительной, 14-й, главе нами осуществлена попытка отобразить изменения методов секвенирования ДНК, произошедшие с ними за эти годы и описанные в данной книге. [c.11]

В процессе написания данной книги было проанализировано большое количество литературных источников, из которых приблизительно пятая часть по разным причинам не была включена в окончательные списки цитируемой литературы, состоящей из более чем 1000 источников и охватывающей период с апреля 1953 г. по декабрь 1998 г. Многие из так и непроцитированных статей являются краткими обзорами текущего состояния дел в секвенировании ДНК на момент их написания и за счет этого безнадежно устаревшими. Такая же участь постигла и ряд статей, посвященных рассмотрению перспектив развития методов секвенирования ДНК. Однако самая большая доля непроцитированных работ принадлежит статьям, посвященным компьютерному анализу нуклеотидных последовательностей, потерявшим свою актуальность благодаря чрезвычайно быстрому совершенствованию компьютерной техники. Что касается цитируемой в данной книге литературы, то она, за редкими исключениями, представлена методическими статьями, посвященными описанию новых методов или их модификации. К исключениям же относятся статьи, являющиеся настоящими вехами в молекулярной биологии, как, например, статьи Дж. Уотсона и Ф. Крика, опубликованны в журнале Nature в 1953 г. или статьи, описывающие секвенирование и анализ полных геномов каких-либо организмов. [c.12]

Возможно, более правильным и точнее отражающим ее суть, было бы назвать данную книгу Эволюционное развитие методов секвенирования ДНК , однако мы решили ограничиться названием Секвенирование ДНК . И тому есть целый ряд причин. Во-первых, в таком случае нам пришлось бы значительно углубиться в 1960-е годы и самое начало 1970-х, что уже было сделано до нас путем перевода книги С. Манде леса Установление первичной структуры нуклеиновых кислот (М. Мир, 1975). Во-вторых, ввиду полного отсутствия подобных изданий на русском языке, включая и переводные (которых нет, кроме уже упомянутой выше книги С. Манделеса, весьма устарев- [c.12]

Возможность получения благодаря разработанным методам секвенирования ДНК принципиально новых сведений в виде генетических текстов, ранее недоступных, оказала значительное влияние на дальнейшее развитие не только самой молекулярной биологии, но и общей биологии и других смежных областей знаний. Заставила по-новому взгля- [c.15]

Следует отметить, что классические методы секвенирования ДНК химической деградацией и ферментативным построением комплементарной цепи в условиях специфической терминации, являющиеся главным предметом рассмотрения в этой книге, кардинально различаясь в своих подходах, требуют разделения меченых фрагментов ДНК, отличающихся по длине на один нуклеотид, в полиакриламидном гель-элек-трофорезе высокого разрешения. Все составляющие процесса секвенирования ДНК как тем, так и другим методами за годы прошедшие с их разработки, подверглись сильной модификации, и производительность сегодняшнего секвенирования ДНК просто поражает. Однако отражение только нынешнего состояния дел в этой области молекулярной биологии в отрыве от некой цепочки последовательных улучшений той или иной составляющей этих методов не способно показать тот огромный прогресс, который был достигнут усилиями очень многих ученых. [c.17]

В основе метода секвенирования ДНК путем химической деградации лежит ограниченное расщепление меченого фрагмента ДНК под действием специфических реагентов. Непременным условием проведения секвенирования этим методом является наличие фрагмента ДНК, меченного только по одному концу. Разделение продуктов деградации по размеру с помощью высоковольтного электрофореза в полиакриламидном геле высокого разрешения, способного разделять фрагменты ДНК, различающиеся между собой по длине всего на один нуклеотид в достаточно широком диапазоне, и последующая радиоавтография геля позволяет определить нуклеотидную последовательность секвениро-ванного участка ДНК. [c.20]

Метод секвенирования ДНК путем химической деградации применим как для одно-, так и для двуцепочечных фрагментов, но, как уже отмечалось выше, непременным условием является наличие в секвенируемом фрагменте только одного гомогенного меченого конца. Как правило, в результате мечения двуцепочечного фрагмента ДНК обра- [c.24]

Условия проведения химических реакций в методе секвенирования ДНК по Максаму-Гилберту [c.36]

Поскольку в основе метода ферментативного секвенирования лежит построение новой комплементарной цепи ДНК по уже имеющейся, то большое значение приобретает подготовка молекул ДНК для осуществления этого процесса. Так, если для метода секвенирования ДНК химической деградацией было необходимо наличие одно- или двуцепочечного фрагмента, нe 5ш eгo на одном (гомогенном) из своих концов единственную метку, то для секвенирования ферментативным методом необходимо наличие немеченной матрицы ДНК и при этом желательно одноцепочечной. Хотя, справедливости ради, следует отметить, что матрица ДНК, несущая какую-либо метку (включая и радиоактивную), в большинстве случаев не окажет заметного влияния на заключительный радиоавтограф из-за большой разницы в размерах самой матрицы и вновь синтезированной в условиях терминации цепи ДНК. Что касается матрицы ДНК, один из концов которой несет метку в виде молекулы биотина, то в этом случае возможна ее сорбция на твердой фазе, например, на магнитных частицах со стрептавидином и проведение так называемого твердофазного секвенирования. При этом выхода биотинилированной метки в заключительный раствор терминирующей смеси, содержащей комплементарную цепь ДНК, меченную уже как-то по-другому и предназначенную для нанесения на секвенирующий гель, даже не произойдет. [c.48]

Смотреть страницы где упоминается термин Методы секвенирования ДНК: [c.109] [c.88] [c.89] [c.101] [c.236] [c.39] [c.38] [c.134] [c.39] [c.15] [c.16] [c.17] [c.19] [c.19] [c.20] [c.33] [c.39] [c.44] [c.46] [c.52] [c.86] [c.98]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология