Фрагменты электрофорез

Последовательность образующихся при рестрикции фрагментов в интактной молекуле ДНК можно установить несколькими способами. Прежде всего можно использовать неполное расщепление ДНК эндонуклеазами и последующее разделение фрагментов электрофорезом. Затем [c.271]

Разделение фрагментов электрофорезом в агарозном геле [c.310]

Рис. 2.2, Со5-картирование. Радиоактивные олигонуклеотиды, комплементарные левому или правому липкому концу, гибридизируют с соответствующим сайтом. Затем проводят частичный гидролиз рестриктазой К, разделение фрагментов электрофорезом в агарозном геле и радиоавтографию, позволяющую идентифицировать все меченые фрагменты, полученные в результате неполного гидролиза. Молекулярную массу истинных рестрикционных фрагментов, легко вычислить путем вычитания меньших величин из больших.

Фракционирование нуклеиновых кислот и их фрагментов электрофорезом в ПААГ и гелях агарозы отличается от фракционирования белков некоторыми характерными особенностями, вытекающими из различия природы этих биополимеров. Главное, что отличает нуклеиновые кислоты,— это неизменно отрицательный и значительный по величине суммарный электрический заряд, обусловленный диссоциацией многочисленных остатков фосфорной кислоты. Величина этого заряда мало зависит от pH окружающей среды, а отношение заряда к массе практически одинаково для всех нуклеиновых кислот, поэтому в подавляющем большинстве случаев фракционирование их при электрофорезе идет за счет различия размеров молекул, а. не их зарядов. [c.120]

Рис. 91. Отпечаток на рентгеновской пленке геля после электрофореза смеси радиоактивных фрагментов РНК (транспортной рибонуклеиновой кислоты) длиной от 40 до 72 остатков

Согласно той же формуле (18.4) коэффициент диффузии обратно пропорционален вязкости растворителя. Поэтому особенно высокого качества разделения удается достигнуть, проводя электрофорез в гелях, вязкость которых чрезвычайно высока. Для разделения белков и нуклеиновых кислот наиболее широко используются полиакриламидные гели (см. 8.5). С помощью электрофореза в таких гелях удается в один прием разделить десятки компонентов. В качестве иллюстрации на рис. 91 приведен результат разделения смеси фрагментов нуклеиновой кислоты разной длины от 40 до 72 нуклеотидных звеньев. Электрофорезу подвергались фрагменты, меченые радиоактивным фосфором После завершения разде- [c.331]

Ларсон и соавторы в аналитических опытах на микроколонке (0,15 X 10 см) исследовали оптимальные условия для фракционирования рестриктов ДНК в системе ХОФ-5 при среднем давлении ( 33 атм) и скорости элюции 13 мл/ч. Наилучшее разделение 17 фрагментов размерами от 43 до 850 пар оснований получалось у них при использовании очень пологого линейного градиента (0,55—0,75 М K I) объемом 40 мл (220 Fj) в нейтральном буфере при температуре 43°. Повышение температуры, по их данным, затрудняет элюцию ДНК и растягивает ее профиль. Удается разделить фрагменты длиной 98 и 102 пары оснований, чего далеко не всегда можно добиться с помощью электрофореза. Длина липких концов рестриктов и их состав влияют на разделение, равно как и нуклеотидный состав ДНК и даже последовательность оснований. Подчеркивается нео - [c.173]

Разделение фрагментов ДНК одинаковой длины, но различного нуклеотидного состава (что невозможно при электрофорезе), в частности отделение АТ-богатых фрагментов, которые сильнее задерживаются в системе ХОФ-5. [c.174]

При разделении нуклеиновых кислот используют те же методы, что и при фракционировании белков, однако имеются ограничения, обусловленные большим диапазоном величин молекулярной массы (2-10 —Ы0 ° Да), отклонениями от глобулярной формы, различиями в четвертичной структуре (двухнитевые, однонитевые, кольцевые), значительным отрицательным зарядом в нейтральной области pH. Поэтому методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии не получили широкого распространения при фракционировании нуклеиновых кислот и значительно уступают ультрацентрифугированию и электрофоретическому разделению в геле агарозы, полиакриламидном геле или их смеси. Поскольку величина отрицательного заряда нуклеиновых кислот и продуктов их расщепления мало зависит от pH, а отношение заряда к молекулярной массе сохраняется практически неизменным, разделение нуклеиновых кислот при электрофорезе определяется не их зарядом, а размером молекул. При наличии маркеров с известной молекулярной массой возможно определение молекулярной массы препаратов нуклеиновых кислот и их фрагментов. [c.171]

Сложную картину с большим числом полос наблюдают при электрофорезе препарата тяжелого меромиозина в присутствии додецилсульфата натрия. В этом случае представляет интерес сопоставить данные по электрофорезу препарата ТММ (тяжелого меромиозина) в диссоциирующих и в недиссоциирующих условиях. Нативный электрофорез в этом случае проводят в трис-глициновом буфере (pH 8,9) на пластинах с 5%-ным разделяющим гелем и 2,5—3%-ным концентрирующим гелем. В этом случае препарат тяжелого меромиозина дает в основном одну полосу, расположенную недалеко от старта, с м. м. 350 ООО Да. Это свидетельствует о том, что, несмотря на наличие многочисленных внутренних разрывов в полипептидных цепях, возникших в результате протеолиза, фрагменты цепей держатся вместе за счет нековалентного взаимодействия. При этом обеспечивается функциональная целостность структуры (сохранение АТФазной активности). [c.397]

Весьма ценной разновидностью обычной тонкослойной или бумажной хроматографии является диагональная хроматография. Сначала нанесенный материал хроматографируют в одном направлении, затем в тонком слое на пластинке или бумаге проводят определенную химическую реакцию, после чего осуществляют разделение в другом направлении. Немодифицированные соединения располагаются по диагонали пластинки, тогда как продукты реакции оказываются смещенными по отношению к ней. Этим методом исследовали фотохимические [149] и другие [147] реакции флавинов. Аналогичный диагональный электрофорез применялся для идентификации пар —8Н-групп, образующих в белках дисульфидные мостики [150]. Пептидные фрагменты, содержащие 8—8-мостики, разделяли с помощью электрофореза на бумаге, затем обрабатывали бумагу парами надмуравьиной кислоты, разрывающей мостики [уравнение (2-20)], и после электрофореза в перпендикулярном направлении опрыскивали бумагу нингидрином. Пятна, расположенные вне диагонали, соответствовали фрагментам, которые участвовали в образовании 8—8-мостиков. По положению пятен подбирали [c.180]

Сильный подъем в применении КЭ, особенно КГЭ, а также появление в продаже промышленных приборов связаны с американским проектом "Геном человека". С помощью метода КГЭ практически полностью были разделены молекулы ДНК в реакции определения последовательности нуклеотидов ДНК или остаточных фрагментов. Из применяемых типов гелей в классическом планарном гелевом электрофорезе в капиллярах в качестве матриц применяют в основном акриламид, агарозу и целлюлозу. Эти гели очень сильно различаются по своим физическим свойствам, таким как вязкость, стабильность в электрическом поле, пористая структура и размер пор. [c.96]

Вновь синтезируемые цепи получают радиоактивно меченными за счет включения Фрагменты различной длины, синтез каждого из которых останавливается перед заданным основанием, получают лимитированием подачи этого основания. В результате протекания четырех параллельных синтезов, осуществляемых в условиях дефицита по А, С, G и Т, соответственно, происходят остановки перед различными основаниями (—А, —С, —G и —Т). Одновременный электрофорез этих четырех образцов дает последовательность полос на авторадиограмме, с которой можно непосредственно считать последовательность примерно 100—150 остатков. [c.189]

Широко применяемый для изучения биополимеров метод гель-электрофореза основан на различной подвижности макромолекул и их фрагментов в электрическом поле. Для разделения и исследования белков гель-электрофорез производится с додецилсульфатом натрия (ДСП), который связывается с молекулой белка, вызывая ее денатурацию. Подвижность молекулы в геле, на который наложено электрическое поле, зависит не только от заряда, но и от размеров молекулы (диффузионный эффект). [c.33]

Мы уже упоминали о методе гель-электрофореза (с. 33). Молекулы ДНК, несущие отрицательные заряды на фосфатных группах, перемещаются в электрическом поле на разные расстояния в зависимости от своих размеров. С помощью рестриктаз ДПК делится на ряд фрагментов, которые разделяются посред- [c.268]

Допустим, что выделенный образец ДНК содержит тождественные однонитевые фрагменты. Начала этих фрагментов метят, пришивая к ним " Р. Другой конец цепи не несет метки. Образец делят на четыре части. К первой из них добавляют вещество, рвущее нить вблизи аденина (А) с тем расчетом, чтобы в среднем в каждом фрагменте происходил один разрыв. Возникают уменьшенные субфрагменты разной длины, в том числе несущие метки Таким же способом определяют субфрагменты разрывами цепи вблизи Т, Г и Ц. Полученные четыре образца разделяют параллельно методом гель-электрофореза. После этого на гель накладывается фотопластинка, на которой отпечатываются те полоски в геле, которые несут радиоактивную метку. Схематически полученный результат показан на рис. 8.7. Последовательность непосредственно читается по электрофореграмме. В одном опыте удается прочесть текст длиною до 500 нуклеотидов. [c.269]

Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фрагментов, одновременно проводят электрофорез маркерных макромолекул с известными молекулярными массами. Набор маркеров должен охватывать весь диапазон молекулярных масс в данной системе. Образец маркерных молекул вносят в отдельную лунку, расположенную вблизи одного из краев пластинки (или в две лунки у двух разных краев). Логарифм относительной молекулярной массы маркера линейно связан с его электрофоретической подвижностью Rf — величиной, равной отношению расстояний, пройденных маркерной молекулой и красителем (фронтом растворителя). Построив график зависимости логарифма относительных молекулярных масс маркеров от Кр можно найти относительную молекулярную массу каждого компонента образца. Относительная мол. масса белков измеряется в Дальтонах, двухцепочечных нуклеиновых кислот — в числе пар нуклеотидов, одноцепочечных — в числе нуклеотидов. [c.54]

В середине 1960-х годов начались исследования нуклеотидных последовательностей РНК. Первыми были определены первичные структуры тРНК (Р. Холли и сотр., 1965 А. А. Баев и сотр., 1967). Развитие техники фракционирования фрагментов нуклеиновых кислот и прежде всего гель-электрофореза (Ф. Сэнгер и сотр.) позволило в начале 1970-х годов приступить к изучению первичной структуры высокомолекулярных РНК. В 1976—1978 гг. были созданы исключительно быстрые и эффективные методы секвени-рования ДНК и РНК (А. Максам и У. Гилберт, Ф. Сэнгер и сотр.), которые позволили за короткое время получить огромную информацию о первичной структуре генов, их регуляторных элементах, вирусных и рибосомных РНК и т. д. [c.7]

Длины фрагментов определяют с помощью высокоразрешающего электрофореза в тонком слое пшиакриламидного геля. Электрофорез проводится при повышенной температуре в буферной систе.ме, содержащей 7 М мочевину, что способствует разрушению вторичной структуры фрагментов детекция зон фрагментов на электрофореграмме зависит от способа мечения его конца (если это [c.16]

Идентификация модифицированных нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи РНК долгое время была задачей особой трудности. С появлением современных методов секвенирования нуклеиновых кислот она существенно упростилась. Модификацию РНК или ее расщепление ферментами ведут таким образом, чтобы (как и при секвенировании) было затронуто в среднем только одно звено на молекулу (в чем есть дополнительный смысл, так как множественная модификация РНК искажает ее структуру). Далее, если изучается РНК небольшого размера или сегмент РНК, примыкающий к одному из ее концов, то этот конец метят радиоактивной меткой и задача идентификации модифицированного основания (после расщепления соответствующего звена) или атакованной нуклеазой межнуклеотидной связи сводится, как и при секвенировании, к определению длины фрагмента по его подвижности в высокоразрешающем электрофорезе в геле. В том случае, когда анализируемый район удален от концов молекулы на расстояние больше 150—200 н. о., используют реакцию обратной транскрипции (см. гл. 13). Для этого синтезируют олигонуклеотид, комплементарный участку РНК, расположенному вблизи от анализируемого района с З -концевой стороны молекулы, и далее используют его как праймер для обратной траискриптазы. Так как этот фермент останавливается на модифицйрованных остатках матрицы (или в том месте, где расщеплена фосфодиэфирная связь), то вновь по длине образующегося фрагмента можно определить положение модифицированного звена в РНК. [c.40]

Рис. 126. Электрофорез фрагментов ДНК, образовавшихся при расщеплении микрококковой нуклеазой. хроматнна печени крысы (левая дорожка) н гриба нейроспоры (Правая дорожка)

Рассмотрим теперь совсем недавний пример разделения ДНК и РНК. Здесь решалась более тонкая задача разделения НК, соизмеримых по своим размерам, а именно очистки ДНК плазмиды pBR 322 от примеси РНК. Присутствие РНК в препаратах плазмидной ДНК мешает протеканию некоторых ферментативных реакций и затемняет результаты введения концевой радиоактивной метки. Оказалось, что даже интенсивная обработка РНКазой (50 мкг/мл, 37°, 1 ч) не расщепляет РНК полностью, а лишь дробит ее на фрагменты, не обнаруживаемые электрофорезом в 1%-ном геле агарозы (они уходят вперед), но переосаждающиеся этанолом вместе с плаз-мидной ДНК. Кроме того, обработка РНКазой вообще нежелательна. Несмотря на предварительный прогрев, в ней остается небольшая [c.143]

Такую смесь меченых фрагментов олигонуклеотида снова подвергают двумерному фракционированию электрофорезом на ацетилцеллюлозе и гомохроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, как описано выше, а затем проводят авторадиографию. Однако теперь вместо разбросанных по всей иластпнке иятен фингерприита получается зигзагообразная цепочка следующих друг за другом пятен (рис. 173), анализ расположения которых дает информацию о последовательности нуклеотпдов в олигонуклеотиде. [c.504]

Далее проводили фосфорилирование всех олигонуклеотидов по 5 -концам радиоактивным фосфором за счет [7- PlATP с помощью Т4-полинуклеотидкпназы. Смесь меченых олигонуклеотидов разделяли электрофорезом в ПААГ, получая лестницу полос, как было описано при рассмотрении электрофореза [Остерман, 1981]. В отличие от методов секвенирования ДНК здесь каждой полоске ( перекладине лестницы ) соответствует фрагмент, укороченный точно на один нуклеотид по сравнению с фрагментом предыдущей полоски. Как и при секвенировании ДНК, меченые гидролизаты наносили в параллельные треки со сдвигом по времени в 4, 8 и И ч, а весь электрофорез проводили в течение 14 ч, с тем чтобы лучше разрешить разные по длине фрагментов участки лестницы . [c.508]

При полном расщеплении ДНК фага X рестриктазой Hind П1 образуются фрагменты, содержащие 23130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564 и 165 пар оснований они могут быть разделены с помощью электрофореза в геле агарозы. [c.175]

Препарат субфрагмента-1, полученного методом химотрипсинового протеолиза, при электрофорезе в ДСН дает полосу фрагмента тяжелых цепей с м. м. 96 ООО Да и две полосы легких цепей — с м. м. 20 ООО— [c.397]

Рассмотренные выше факты привели к концепции, предполагающей, что ( а++К+)-зависимая АТРаза и является, по существу, мембранным ионным нашсом. Для активации фер ментной системы ионы К+ и №+ должны находиться по разные стороны от мембраны. Вместе с тем очищенный фермент должен гидролизовать АТР в пробирке в присутствии Na++K++Mg2+. Этот бетокудалосьвыделитьвочищенном виде [53—56]. При гель-электрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия очищенная (На++К+)-зависимая АТРаза разделяется на две субъединицы. Большая из них представляет собой полипептидную цепь с мол. весом - 95 000—100 000, а меньшая является гликопротеидом с мол. весом 50 000. Антитела к изолированной большой субъединице связываются с фрагментами мембран, принадлежащими, по-видимому, участкам внутренней поверхности плазматической мембраны [57]. Логично предположить, что гликопротеидная субъединица фермента расположена на наружной поверхности мембраны. [c.362]

Далее, возможна прямая локализация спаренных участков цепи. Один из наиболее результативных подходов состоит в том, что после переваривания РНКазой, гидролизующей однотяжевые участки РНК, получающиеся двуспиральные фрагменты разделяются в электрофорезе сначала в неденатурирующих условиях (первое направление), а затем в условиях диссоциации двуспиральных комплексов (второе направление) таким образом, каждая полоса первого направления, представляющая собой двойную спираль, разделяется во втором направлении на два пятна, представляющих собой комплементарные тяжи, которые идентифицируются и локализуются на первичной структуре РНК. Таким путем удается выявить не только смежные (вдоль цепи) комплементарные участки, но и комплементарные взаимодействия между удаленными участками цепи РНК. Другой подход, особенно эффективный в выявлении дальних взаимодействий, состоит в фотоактивируемых сшивках оснований спаренных тяжей в составе структуры РНК с последующей идентификацией сшитых олигонуклеотидов. [c.74]

Сенжер и Коулсон создали метод анализа последовательности ДНК, который основан на ферментативном копировании однонитевых частиц ДНК [18]. Максам и Гилберт создали метод, в основу которого положена химическая модификация четырех оснований, входящих в состав ДНК, и который с одинаковым успехом применим как к однонитевым, так и к двунитевым молекулам ДНК [19]. Оба метода используют авторадиографическое определение згр-меченных олигонуклеотидов, которые разделяют в зависимости от их длины электрофорезом денатурированных фрагментов в полиакриламидном геле. На практике, успех этих методов во многом определяется недавними достижениями в энзимологии нуклеиновых кислот, особенно использованием ферментов рестрикции, расщепляющих молекулы ДНК, и обратной транскриптазы, с помощью которой получают циклические ДНК, комплиментарные РНК-матрице. Нижеследующее описание методики анализа будет, однако, предполагать наличие гомогенных образцов ДНК подходящей длины. [c.188]

Ялюс -процедура включает экзонуклеолитическое расщепление синтетических фрагментов ДНК путем удаления одного за другим оснований с З -конца. Эта процедура требует применения модифицированной ДНК-полимеразы I, которую можно останавливать в определенных положениях разрушаемой последовательности добавлением одного из четырех нуклеозидтрифосфатов. Снова, проводя параллельно четыре реакции, каждая из которых наращивает один нуклеотид (+А, +С, -fG или -f-T), расщепление может быть остановлено перед одним из оснований (А, С, G или Т). Снова гель-электрофорез дает картину ряда полос, с которой можно непосредственно считывать последовательность. Эта методология иллюстрируется рис. 22.4.2. [c.189]

Последовательность аминокислотных остатков в белковой цепи называется ее первичной структурой. Определение первичной структуры производится путем частичного гидролиза белка с помощью протеаз, катализирующих расщепление пептидной связи лишь нежду определенными остатками. Так, трипсин режет лишь связи, образованные СО-группами остатков основных аминокислот — Apr или Лиз. В результате образуется смесь пептидов — коротких фрагментов белковой цепи. Их идентификация производится посредством химических и физико-химических методов (хроматография, электрофорез). Воздействуя вторым ферментом, можно разрезать другие связи в белке и получить смесь других фрагментов (пептидов) и т. д. [c.33]

Обработка образца ДНК определенной рестриктазой всегда дает один и тот же набор фрагментов - при условии, что расщепление происходит по всем сайтам узнавания. Если использовать несколько ферментов рестрикции и сначала обработать ДНК каждой из рестриктаз в отдельности, а затем их комбинациями, можно построить физическую карту данной ДНК, т. е. установить порядок следования сайтов рестрикции вдоль молекулы. Определив размер полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза, можно найти положение рестрикционных сайтов (дополнение 4.1). На рис. 4.4,А указаны размеры фрагментов, полученных в результате расщепления ДНК разными рестриктазами и их смесью. Из этих данных следует, что данный участок ДНК имеет по два сайта для ВатШ и ЕсоШ. [c.53]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология