Ферментный раствор

Таким образом, применение ультрафильтрации позволяет не только концентрировать ферментные растворы с полным сохранением нх ферментативной активности, но и добиваться при наличии соответствующих мембран значительной степени их очистки. [c.287]

КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ ФЕРМЕНТНЫХ РАСТВОРОВ [c.168]

Рис. 60. Принципиальная схема ультрафильтрационной установки для концентрирования ферментных растворов.

При добавлении к ферментному раствору соли может происходить интенсивное выделение пузырьков воздуха. Поэтому необходимо предварительно ее измельчить и добавлять небольшими порциями. Переливать раствор из сосуда в сосуд нужно медленно, по стенке сосуда, с помощью стеклянной палочки. [c.197]

По окончании термической обработки ферментный раствор быстро охлаждают в сосуде с тающим льдом, интенсивно перемешивают, пока температура не снизится на 10—20° С. Охлаждать после тепловой обработки можно и в ацетоновой бане с сухим льдом при температуре около —8° С. Необходимо лишь не допускать замерзания ферментного раствора. [c.199]

На рис. 26 изображена одна из возможных установок для фракционирования органическими растворителями. Ферментный раствор наливается в стеклянный стакан 3, помеш,енный в спиртовую баню 4. Уровень спирта после добавления органического растворителя должен несколько превышать уровень жидкости в стакане (определяют заранее). [c.202]

Рис 26. Установка для фракционирования белков органическими растворителями. Спиртовая баня (/) для охлаждения органического растворителя, помещенного в делительную воронку (2) стеклянный стакан с ферментным раствором (3), охлаждающимся в спиртовой бане (4) [c.202]

Спиртовую баню ставят на магнитную мешалку или используют механическую мешалку (см. рис. 26). Стакан с ферментным раствором должен иметь ровное дно, в противном случае трудно добиться интенсивного и равномерного перемешивания, так как магнит мешалки будет постоянно сбиваться к стенкам стакана. [c.202]

В бане 4 доводят температуру примерно до —3 С. Ферментный раствор наливают в стакан 3, помещают его в спиртовую баню 4 и сразу же включают мешалку. По достижении температуры ферментного раствора 0 С начинают добавлять из сосуда 2 органический растворитель и следят за тем, чтобы он стекал тонкой струйкой по стенке стакана, успевая перемешиваться с раствором, а не наслаивался бы на его поверхности. [c.203]

Здесь следует отметить несколько моментов. При 0° С и ниже ферментный раствор может замерзнуть, поэтому нельзя сразу сильно понижать его температуру. С другой стороны, добавление органического растворителя сопровождается повышением температуры ферментного раствора, поэтому его следует приливать постепенно, особенно в самом начале, регулируя скорость его поступления так, чтобы раствор в стакане 3 не нагревался выше 0 С. По мере повышения концентрации органического растворителя температура замерзания раствора понижается и можно вести работу при более сильном охлаждении, что достигается добавлением в баню 4 нескольких кусочков сухого льда. Приливая новые порции органического растворителя, температуру в стакане постепенно понижают до нужного значения. При получении последующих фракций в ферментном растворе уже будет содержаться определенное количество органического растворителя, поэтому не будет и опасности замерзания раствора при минусовой температуре. Не будет происходить и его разогревания. [c.203]

Необходимое количество геля подбирают следующим образом. В несколько пробирок наливают одинаковое количество ферментного раствора (минимальный объем) и добавляют разные количества геля. Перемешивают до получения однородной суспензии, центрифугируют и в центрифуге определяют ферментативную активность. То соотношение геля к ферментному раствору, при котором в надосадочной жидкости остается примерно 90% первоначальной активности при адсорбции балластных белков и около 10% при адсорбции исследуемого фермента, считается оптимальным. На основании полученного соотношения рассчитывают количество геля, которое необходимо добавить на весь объем ферментного раствора. [c.204]

В другом варианте ко всему объему ферментного раствора добавляют определенное (обычно небольшое) количество геля, перемешивают, центрифугируют и в центрифугате, не сливая его с осадка, а только отбирая нужный объем, измеряют ферментативную активность. Процедуру повторяют до тех пор, пока не будет достигнут нужный эффект. [c.204]

С помощью избирательной адсорбции можно сконцентрировать ферментный раствор, если первоначальный объем его был большим, а концентрация фермента в нем невысока — элюция обычно осуществляется небольшим объемом. [c.204]

Используют также диализ ферментного раствора против насыщенного раствора сульфата аммония, опять же до появления слабой мути. [c.205]

Другой способ хранения — в замороженном состоянии (при температуре ниже —25° С). Перед замораживаем ферментный раствор-разливают по отдельным пробиркам, чтобы каждую порцию подвергать замораживанию и оттаиванию только один раз. [c.206]

Кристаллизация. Ферментный раствор центрифугируют 5 мин при 40 000 д, осадок отбрасывают к центрифугату медленно, при перемешивании, добавляют сульфат аммония из расчета 3,6 г на каждые 10 мл. Через 20 мин после окончания добавления центрифугируют 15 мин при 40 000 я, осадок растворяют в 15—20 мл холодной воды, добавляют сульфат аммония в количестве 2 г на каждые 10 мл и центрифугируют 10 мин при 40 000 g. Осадок отбрасывают, к центрифугату медленно, при осторожном перемешивании, в течение нескольких часов добавляют сульфат аммония до насыщения 0,6. [c.278]

После того как весь этанол добавлен (0,5 объема по отношению к объему ферментного раствора), раствор перемешивают еще 5 мин, после чего центрифугируют при —6°С в течение 10 мин (18 000 д). Центрифугат отбрасывают, осадок размешивают при комнатной температуре в 6—10 мл воды и центрифугируют повторно при 2—4° С в течение 10 мин (40 000 ). Осадок отбрасывают. На этой стадии ферментный раствор может храниться 3—4 дня в холодной комнате или 10—12 дней при —16° С без потери ферментативной активности. Перед использованием для дальнейшей очистки его центрифугируют, как указано выше, и осадок отбрасывают. [c.284]

Фракционирование сульфатом аммония. К ферментному раствору добавляют при перемешивании сульфат аммония из расчета 2,9 г на каждые 10 мл. Добавлением 1 М раствора калиевой щелочи доводят pH до 7,6 и оставляют при перемешивании на 15 мин. Если выпадает осадок, его удаляют центрифугированием при 40 ООО в течение 5 мин. К центрифугату при комнатной температуре добавляют еще сульфат аммония (1,3 г на каждые 10 мл раствора) и через 30 мин центрифугируют 15 мин при 40 000 д. Центрифугат отбрасывают, осадок растворяют в 5 мМ фосфатном буфере (pH 7,7) до получения конечной концентрации белка, равной 2 мг/мл. К полученному раствору добавляют сухой сульфат аммония до насыщения 0,5, и если выпал осадок, центрифугируют 5 мин при 40 ООО д. Осадок отбрасывают, к центрифугату добавляют КОН до pH 7,6 и затем насыщенный раствор сульфата аммония (pH 7,6) до насыщения 0,55. Через 15 мин центрифугируют при 40 ООО д в течение 10 мин. [c.284]

Первое фракционирование сульфатом аммония. К ферментному раствору, полученному на предыдущей стадии, добавляют порошок сульфата аммония до насыщения 0,5. Раствор перемешивают 15 мин, после чего центрифугируют 15 мин при 40 ООО g. Осадок отбрасывают, к центрифугату добавляют еще сульфат аммония до насыщения 0,75, перемешивают 15 мин, затем снова центрифугируют при тех же условиях. Центрифугат отбрасывают, осадок растворяют в 15 мл 0,05 М трис-НС1 буфера (pH 8,5). В замороженном виде полученный раствор может храниться в течение суток без потери транскетолазной активности. [c.286]

Второе фракционирование сульфатом аммония. К ферментному раствору, полученному на предыдущей стадии, добавляют насыщенный раствор сульфата аммония (pH 8,5) до насыщения 0,5. Перемешивают 15 мин, центрифугируют 10 мин при 40 000 g и осадок отбрасывают. К центрифугату добавляют еще насыщенный раствор сульфата аммония (pH 8,5) до насыщения 0,75. Перемешивают 30 мин, центрифугируют 15 мин при 40 000 g, центрифугат отбрасывают осадок растворяют в минимальном объеме 0,05 М трис-НС1 буфера (pH 8,5). [c.286]

Постановка пробного эксперимента. В химические пробирки наливают по 0,8 мл раствора рибозо-5-фосфата, в одну из них — 0,2 мл основного ферментного раствора, в остальные — по 0,2 мл ферментного раствора, предварительно разведенного холодной водой в 2, 5, 10 и 20 раз. Перемешивают и ставят на инкубацию в водяной термостат при 38° С. [c.289]

Проведение испытания. В две пробирки длиной 180 и диаметром 20 мм вводят пипеткой по 10 мл 1%-ного раствора мальтозы. Пробирки с субстратом помещают на 10 мпн в термостат с температурой 30 0,2° С. Через 10 инн в пробирки вводят от 1 до 5 мл исследуемого ферментного раствора и тщательно перемешивают. Общий объем реакционной смеси должен быть 15 мл. Если на определенпе берут меньше 5 мл ферментного раствора, недостающий объем дополняют дистиллированной водой непосредственно перед введением ферментного раствора. [c.294]

Если эта величина меньше 0,5 или больше 4,4 мл, испытание повторяют с большей или меньшей дозировкой ферментного препарата, меняя прн этом количество вводимого ферментного раствора или его разведение. [c.295]

Приготовление 2%-ного раствора крахмала (субстрат), 1 и. раствора соляной кислоты, фосфатного буферного раствора с pH 4,8—4,9, ферментных растворов — как и при определении АС солода. [c.300]

При получении фермеитных препаратов пз культу]) микроорганизмов неотъемлемой стадией технологического процесса является концентрирование ферментных растворов с применением таких методов, как вакуум-вьшарива ие, сублимационная сушка, сушка распылением, вымораживание, осаждение органическими растворителями или солями и ряд других. [c.286]

В указанных методах колцептрпрованне раствора связано либо с действием температур, либо с глубокими изменениями физико-химических свойств ферментного раствора. Разбавленные растворы, обычно содержащие различные низкомолекулярные вещества, способные образовывать осадки, с помощью ультрафильтрации могут быть легко очищены. и сконцентрированы, причем более качественно и быстрее, чем при использовании выпаривания, вымораживания или других широкораспространенных методов. [c.286]

Стадия очистки Объем ферментного раствора Активность в 1 мл Общая с ктив- ность Белок, мг Удельная актив- ность Степень очистки Выход фер мента, % от исходной активлости [c.198]

Тепловую обработку лучше проводить в круглодонной колбе (можно и в химическом стакане), помещая ее в водяной термостат. Чтобы ускорить процесс нагревания ферментного раствора, его погружают в водяную баню с температурой, на 20—30° С выше той, при которой пройдет тепловая стадия. Энергичное перемешивание, необходимое для равномерного нагревании, осуществляется быстрым вращением сосуда с раствором или с помощью механической мешалки. [c.199]

Фракционирование метанолом. К ферментному раствору при перемешивании добавляют в течение 3 ч ПО мл ледяного метанола, центрифугируют 10 мин при 40 ОООи осадок отбрасывают. Центрифугат упаривают наполовину в роторном испарителе при 20 °С и добавляют к нему при перемешивании 53 г сульфата аммония. Перемешивание продолжают при 20 °С еще 2 ч, центрифугируют 20 мин при 40 ООО я, осадок растворяют в минимальном объеме холодной воды и диализуют в течение ночи против 5 л воды при перемешивании. [c.252]

Хроматография на ДЭАЭ-сефадексе А-25. Через колонку с подвижным адаптером с ДЭАЭ-сефадексом Л-25 (5x26 см), уравновешенную 0,02 М трис-НС1 буфером (pH 9,2), пропускают последовательно (снизу вверх) 1 л 0,02 М раствора хлористого калия и ферментный раствор, полученный на предыдущей стадии. Как только ферментный раствор полностью впитывается, начинают пропускать 0,1 М хлористый калий, который используется в качестве элюирующего раствора. Скорость элюции — 90 мл/ч, объем элюируемых фракций — 3 мл. Во фракциях определяют белок и транскетолазную активность. Фракции с удельной активностью 0,1 Е/мг и выше объединяют и используют для дальнейшей работы (можно хранить в холодильнике в течение ночи). [c.286]

Гель-фильтрация на сефадексе G-200. На колонку с сефадексом G-200 (1,5X50 см), уравновешенным 0,05 М трис-НС1 буфером (pH 8,5), наносят ферментный раствор, полученный на предыдущей стадии. Элюцию белка осуществляют тем же буфером, собирая фракции по 2,5 мл со скоростью 3—4 мл/ч. Фракции элюата, содержащие транскетолазную активность, объединяют и хранят в замороженном состоянии при —16° С. [c.286]

По прошествии указанного времени отбирают небольшой объем ферментного раствора, центрифугируют 10 мин при 40 000 и в центрифугате измеряют фруктозодифосфатальдолазную активность (с. 246). Если она обнаруживается (в противном случае концентрацию сульфата аммония в основном ферментативном растворе сразу доводят до насыщения 0,72 см. ниже), к основному ферментному раствору добавляют еще насыщенный раствор сульфата аммония (pH 7,5) до получения конечной концентрации, равной насыщению 0,54. Оставляют ла 2 ч при периодическом перемещивании, после чего центрифугируют [c.291]

Определение концентрации сухих веществ в сиропе. Метод о6-юван па определении относительной плотности исследуемого пре-[арата. Ферментный раствор в виде сиропа наливают в цилиндр местимостью 100 мл, доводят температуру до 20° С ив сироп осто-ожно погружают сахарометр. Шейку прибора принудительно по-ружают иа 2—3 деления и после установления равновесия пронз-одят отсчет. [c.281]

Проведение испытаиия. В две пробирки (контрольную и опытную) наливают по 10 мл 1%-ного раствора крахмала и ставят в ультратермостат или водяную баню с температурой 30 0,2° С на 5—10 мин. Затем, не вынимая пробирок из термостата, наливают в контрольную пробирку 5 мл дистиллированной воды, а в опытную—5 мл ферментного раствора. Смеси быстро перемешивают и выдерживают в термостате в течение 10 мин (по секундомеру). [c.286]

Через 10 мин после добавления ферментного раствора действие [)ермента приостанавливают добазленисм 2 мл I н. раствора соля-юй кислоты. Для определения количества образовавшихся редуцирующих углеводов содержимое колб после осахаривания количе-твенно переносят в коническую колбу вместимостью 300—400 мл, уда же добавляют пипеткой 20 мл 0,1 н. раствора йода и 60 мл , 1 и. раствора гидроксида натрня или калия (гидроксид приливаюг [О каплям при перемешивании). [c.291]

Одновременно ставят контрольный опыт в конической колбе с еми же количествами всех реагентов, только ферментный раствор водят после добавления 2 мл I и. раствора соляной кпслоты (без ыдержки в водяной бане). [c.291]

Одновременно ставят контрольный опыт, в котором к 10 мл 1%-ного раствора мальтозы добавляют сначала 2 мл 1 н. раствора НС1, а затем ферментный раствор. По разности между количеством 0,1 н. раствора тиосульфата, израсходованного на титрование контрольного и опытного растворов, определяют количество гидролизованной мальтозы. [c.295]

Обработка результатов. Мальтазную активность МС (в ед./г или ед./мл) для ферментных препаратов определяют по формуле МС=А-5Р (т ЮОО), где А—величина активности, найденная по табл. 90 Р — разведение m — количество ферментного раствора, взятое для испытания, мл. [c.295]

Если на испытание взято 5 мл ферментного раствора в разведении 1 100, то мальтазную активность (в ед./г или ед./мл) культуры гриба и сиропа определяют по формуле УИС= А-5Р/(т 100). [c.295]

Приготовление ферментных растворов. Солод измельчают на механической или ручной мельнице и берут навескн [c.298]

Проведение испытания. Ферментативная реакция гид-)олиза крахмала проводится в строго определенных стандартных ус-ювиях температура 30° С, pH среды 4,8—4,9 для солодовых амилаз с использованием фосфатного буфера), продолжительность 10 мин, онцентрация субстрата 1%, объем реакционной смеси 15 мл (10 мл убстрата и 5 мл ферментного раствора). [c.299]

Проведение испытания. Ферментативную реакцию проводят в строго определенных условиях температура 50° С pH 4,8— 4,9 (фосфатный буфер для солодов) продолжительность 30 мпк. объем реакционной смеси 30 мл (20 мл субстрата и 10 мл ферментного раствора). Анализ проводят в пробирках диаметром 18 и длиной 180 мм. В опытную пробирку наливают 20 мл субстрата и ставят в ультратермостат (или водяную баию) с постоянной температурой 50 0,2° С на 5—10 мин. Затем в пробирку наливают 10 м. рабочего ферментного раствора, перемешивают и оставляют стоять в термостате ровно 30 мин. По истечении этого времени пробирку вынимают из термостата, добавляют 1 мл 1 н. раствора соляной кислоты для инактивирования ферментов. Для осаждения белков и осветления гидролпзата приливают 1 мл 30%-ного раствора сульфата цинка и через некоторое время 1 мл 15%-ного раствора гексациано-(И)-ферроата калия. [c.301]

В контрольную пробирку наливают последовательно 10 мл ферментного раствора, 1 мл 1 н. раствора соляной кислоты, по 1 мл оса-днтелей и 20 мл субстрата. [c.301]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология