Расплетание ДНК скорость

Приведенные на рис. 23.16 данные говорят о том, что расплетание двойной спирали нужно исследовать методом температурного скачка, при котором образец переводился бы в условия, соответствующие степени денатурации не более чем 75%. Если бы такое исследование проводилось для олигомерных комплексов, цепи которых не могут разойтись (естественной моделью такой системы являются шпильки), оно бы показало, что время релаксации не зависит от концентрации цепей. Для нативной ДНК, однако, кинетика расплетания оказывается удивительно сложной (рис. 23.17). Прежде всего обращает на себя внимание малая скорость расплетания. Для плавления внутримолекулярных шпилек вблизи 7" времена релаксации составляют около 10 с, а для ДНК, хотя данные и не описываются одним временем релаксации, характерные времена процесса расплетания составляют 10 — 10 с. Можно грубо оценить время плавления ДНК, основываясь на данных для модельных олигомеров. Предположим, что лимитирующей стадией яляется расплетание, и будем считать, что оно начинается от одной-единственной петли. Это даст нам максимальное возможное время плавления ДНК, поскольку в действительности. [c.344]

Кинетические процессы, соответствующие конформационным изменениям в нуклеиновых кислотах, характеризуются широким диапазоном времен релаксации. Образование изолированных пар оснований и стэкинга оснований происходит за время порядка наносекунд. Короткие двойные спирали могут образовываться с константой скорости около 10 М с При этом быстро образуется неустойчивый зародыш спирали, а лимитирующей стадией является, по-видимому, образование второй или третьей пары затем происходит быстрый рост спирали. Кинетика денатурации коротких спиралей оказывается очень быстрой и характеризуется высокой энергией активации. Напротив, кинетика плавления ДНК очень сложна и может быть очень медленной. Это связано с расплетанием частично денатурированной двойной спирали, которое лимитируется трением. [c.380]

В ряде различных способов, которые были придуманы для того, чтобы определить знак и оценить величину т, был использован один общий подход. В качестве эталона сравнения для замкнутой ДНК, в которой предполагали наличие сверхспирализации, использовали ту же ДНК, но с единственным разрывом в одной из цепей (аналогичную форме II ДНК вируса полиомы). Обычно условия в опыте варьируют таким образом, чтобы это приводило к изменению jSp у обеих форм, при этом измеряют какой-либо физический параметр, например скорость седиментации, вязкость, количество связанного лиганда или плавучую плотность. Можно ожидать, например, что депротонирование или связывание с этидием приведет к расплетанию двойной спирали, в результате чего iBq уменьшится. На рис. 24.6 показан типичный результат подобного опыта. С увеличением количества этн-дия, связанного с ДНК, коэффициенты седиментации открытой и замкнутой форм становятся одинаковыми, а затем снова расходятся. В той точке, где обе формы характеризуются одинаковыми значениями какого-либо из перечисленных выше физических параметров, они должны иметь одинаковую форму и содержать одинаковое количество связанных молекул лиганда. Мы будем называть количество связанного этидия в этой точке, приходящееся на пару оснований, критической концентрацией данного лиганда на ДНК. [c.397]

Б. Для демонстрации того, что участки неспаренных оснований расположены в точке начала репликации, можно обработать ДНК рестриктазой, которая разрезает молекулу в строго определенном месте относительно точки начала репликации. (С помощью электронной микроскопии невозможно различить два конца линейной молекулы, поэтому, чтобы точно определить положение расплетенных областей, требуется обработка по крайней мере двумя разными рестриктазами.) Если в точке начала репликации расплетания не происходит, то расплетенные участки не захватят этот сайт (рис. 9-40, А). Если расплетание происходит в точке начала репликации, то расплетенный участок будет включать эту область. В случае когда расплетание распространяется в одном направлении, точка начала репликации совпадает с одним концом области расплетания (рис. 9-40, ). Когда расплетание происходит в обоих направлениях (с одинаковой скоростью), центр расплетенной области совпадает с точкой начала репликации (рис. 9-40, Б). Результаты данного эксперимента указывают на то, что расплетание происходит по обоим направлениям и примерно с одинаковой скоростью. [c.396]

Механизм действия ДНК-полимеразы I, описываемый уравнением (15-2), обеспечивает лишь прямой путь образования комплементарной цепи ДНК каким образом может осуществляться копирование двухцепочечной ДНК, с помощью этого механизма нельзя объяснить. Одна из проблем состоит в том, что для копирования двухцепочечной ДНК две цепи должны расплестись и отделиться одна от другой. Если расплетание цепей и репликация происходят лишь в одной репликационной вилке, как это следует нз экспериментов Кернса, то для того, чтобы хромосома Е. oli могла полностью реплицироваться за 20 мин, вся молекула должна раскручиваться со скоростью 300 оборотов в 1 с. Кроме того, для осуществления процесса репликации в хромосоме должно быть образование типа шарнира (или, по крайней мере, разрыв в одной из цепей) [уравнение (15-3)]. [c.197]

Варшавский и Евдокимов изучали расплетание ДНК методом теплового удара. Раствор ДНК нагревался от 5 до 20°С в течение 0,5 с. Кинетические кривые свидетельствуют о наличии не меноё двух стадий структурного перехода. В первой, быстрой, стадии исчезает почти весь гипохромный зффект. По-видимому, на этой тадии образуются неподвижные петли, полное расплетание которых происходит па второй стадии. Скорость расплетания с/геду-ет уравнению Аррениуса (с. 173), энергия активации процесса сильно зависит от pH, имея максимальное значение при промежуточных pH. [c.244]

РНК-полимераза более активна с двуспиральной, чем с однонитчатой ДНК. Транскрипция in vivo происходит с дву спиральной ДНК, хотя, как уже сказано, считывается одна цепь. Соответственно в точке роста цепи РНК происходит локальное расплетание двойной спирали. С помощью формальдегидного метода, позволяющего обнаруживать дефекты в двойной спирали ДНК, действительно было обнаружено ее расплетание при взаимодействии с ферментом. Скорости синтеза РНК in vivo и в оптимальных условиях in vitro -близки и составляют 20—30 нуклеотидов в секунду. [c.266]

Варшавский и Евдокимов изучали расплетание ДНК методом теплового удара (ср. стр. 474). Раствор ДНК в течение 0,5 сек нагревался на 5—20°С (в зависимости от ионной силы). Кинети ческие кривые свидетельствуют о наличии двух или даже трех стадий структурного перехода. В первой, быстрой, стадии возникает почти весь гиперхромный эффект. Полупериод всего перехода меняется в зависимости от условий в пределах от нескольких секунд до нескольких десятков секунд. Константа скорости следует уравнению Аррениуса. Расплетание спирали происходит с наибольшей скоростью при экстремальных pH — зависимость энергии активации от pH колоколообразна. Максимальное значение Е = 170 ккал/лоль отвечает pH 7,5 (ионная сила 0,18—0,25) оно падает до 20—25 ккал/моль при pH 3 и 10,5, Авторыинтер-претируютпервуюстадию как образование неподвижных петель и считают, что полное расплетение происходит во второй стадии. Время расплетания возрастает с увеличением молекулярного веса. Полученные результаты показывают, что характер зависимости т от М определяется ионной силой раствора, числом и распределением разрывов цепей [127—129]. [c.524]

Исходя из скорости движения репликативной вилки Е. oli, можно заключить, что при 37°С новая ДНК синтезируется со скоростью свыше 45 ООО нуклеотидных остатков в минуту в расчете на одну вилку. Поскольку на каждый полный виток двойной спирали приходится 10 пар оснований (разд. 27.6), скорость расплетания родительской ДНК в репликативной вилке у клеток Е. oli составляет более 4500 об/мин, что превышает скорость вращения вала в двигателе автомобиля, мчащегося со скоростью 110 км/ч. По-видимому, столь быстрое расплетание должно создавать ряд механических проблем для репликации ввиду двуспиральной природы нативных молекул ДНК. Позже мы увидим, каким образом в клетке решаются эти проблемы. [c.898]

Ранние исследования Корнберга и его коллег открыли путь к прямому изучению репликации ДНК, однако и по сей день у нас нет полной и детальной картины процесса репликации, даже в случае вирусной ДНК, образующей всего лишь одну небольщую хромосому. Сегодня благодаря усилиям Корнберга и многих других исследователей мы знаем, что для репликации необходима не только ДНК-полимераза. В этом процессе, по-видимому, участвуют больше двадцати различных ферментов и белков, каждый из которых выполняет определенную функцию, Репликация состоит из большого числа последовательных этапов, которые включают узнавание точки начала репликации, расплетание родительского дуплекса, удержание его цепей на достаточном расстоянии друг от друга, инициацию синтеза новых дочерних цепей, их элонгацию, закручивание цепей в спираль и, наконец, терминацию репликации. Все эти этапы процесса репликации протекают с очень высокой скоростью и исключительной точностью. Весь комплекс, состояший более чем из двадцати репликативных ферментов и факторов, называют ДНК-репликазной системой, или реплисомой. Рассмотрим в общих чертах основные этапы процесса репли- [c.902]

Быстрое раскручивание цепей родительской ДНК в процессе репликации (4500 об/мин) порождает еще одну проблему, которая состоит в том, что при отсутствии специального шарнирного устройства вся хромосома, расположенная впереди репликативной вилки, должна вращаться с такой же скоростью. Предполагают, что избежать этого помогает клетке шарнир в ДНК (возможно, прямо перед репликативной вилкой), благодаря которому вращаться с большой скоростью приходится только короткому участку ДНК. Это может быть достигнуто за счет кратковременного разрыва одной из цепей ДНК, который очень быстро и точно восстанавливается после одного или нескольких оборотов. Кратковременные разрывы и воссоединения осуществляются ферментами, известными под названием топоизомераз. У прокариот топоизомераза называется ДНК-гиразой (от англ. gyration - вращение). Этот фермент не только позволяет ДНК вращаться, но и активно закручивает ее в направлении, благоприятствующем расплетанию цепей матрицы в районе репликативной вилки. Таким образом, гираза помогает хеликазе раскручивать ДНК для ее репликации. Закручивание ДНК с помощью гиразы и сопряженный с этим процессом гидролиз АТР до ADP и Pi, обусловливают сверхспиральное состояние хромосомы. Благодаря гиразе все кольцевые ДНК бактериальных клеток поддерживаются в сверхспиральной форме (рис. 28-14). [c.907]

М. Рекорд и Б. Зимм (М. Re ord, В. Zimm, 1972) пришли к заключению, что сложность наблюдаемого кинетического процесса (рис. 23.17) является следствием изменения во времени параметра, определяющего скорость расплетания. Поэтому не имеет смысла разлагать наблюдаемые кинетические кривые на произвольное число экспонент. Параметр, определяющий скорость процесса, имеет следующие свойства. Он становится постоянным, равным к , при больших временах. При этом процесс образования новых распла ленных участков уже завершен, и происходит только разрастание ранее образовавшихся участков. Константа скорости приблизительно в 20 раз меньше, чем начальная скорость. Она значительно меньше для температурных скачков, приводящих к полной денатурации, чем для небольших температурных возмущений, приводящих к денатурации лишь на 25-50%. Далее, для фиксированной конечной степени расплетания величина обратно пропорциональна молекулярной массе ДНК. Эти факты очень важны, поскольку они означают, что скорость расплетания пары оснований по какой-то причине сильно зависит от длины ДНК и от того, в каком состоянии находятся другие участки ДНК — в спиральном или клубкообразном. [c.345]

Ключ к пониманию всех этих удивительных особенностей кинетики дают физические процессы, которые происходят при денатурации ДНК. Большая часть зародышей денатурированных областей образуется в середине молекулы ДНК, поскольку вероятность расположения АТ-обогашенных участков именно на концах цепей мала. Для роста зародышей необходимо раскрытие пар оснований. Поскольку ДНК является двойной спиралью, раскрытие может происходить, только если один конец растушей петли врашается относительно другого (рис. 23.18). Такое врашение, сопровождающее расплетание, должно происходить вокруг оси спирали. В начальные моменты времени (или при малых степенях денатурации) врашение осуществляется сравнительно легко. Этот процесс зависит от выигрыша свободной энергии АС при выплавлении пары. Ему препятствует трение, но оно довольно мало для длинной палочки, вращающейся вокруг своей продольной оси. По оценкам, начальная скорость вращения достигает 10 оборотов в минуту. Однако по мере плавления вместо довольно обтекаемой спирали появляются объемистые клубкообразные области. Трение при вращении этих областей значительно больше и скорость расплетания ДНК уменьшается. Увеличение трения приводит к тому, что раскручивание цепей становится лимитирующей стадией для оставшейся части процесса плавления. В результате скорость денатурации падает, приближаясь к конечному значению А , которое соответствует плавлению последней небольшой доли пар оснований. Уменьшение при увеличении конечной степени денатурации можно объяснить тем, что при этом возникает все больще клубкообразных областей большего размера. Те же соображения объясняют и заметное уменьшение при увеличении молекулярной массы. Одним из доказательств. [c.346]

В ранних работах лля этилия была получена оценка ф = - 12° при исследовании интеркаляции методом дифракции рентгеновских лучей в пленках и с помощью построения пространственных моделей. В случае щелочного титрования было принято допущение, состоящее в том, что для расплетания одного витка двойной спирали необходимо, чтобы в нем были депротонированы все С и Т. Значения т, полученные в обоих случаях, оказались довольно близкими. В действительности, однако, такое совпадение было, вероятно, в значительной мере случайным, поскольку более поздние оценки ф примерно в два раза превышают ранее полученное значение. Помимо неопределенности в значении ф, существует еще несколько обстоятельств, затрудняющих практическое использование соотношения (24.3). Согласно данным, представленным на рис. 24.6, скорости седиментации форм 1 и II ДНК перекрываются в довольно широкой области, из-за этого трудно точно определить Как мы увидим далее, измерения степени связывания, которые необходимы для того, чтобы определить представляют более сложную задачу в случае сверх-спиральных молекул, чем для незамкнутых кольцевых молекул или линейных двойных спиралей. В конечном счете все, что нам удается найти из опыта, это то значение V, при котором т по абсолютной величине минимально. Но мы не знаем, действительно ли т равно нулю в той точке, которую мы на основании опытных данных называем Принимая во внимание термодинамику сверхспирализации, следует ожидать, что у релаксирован-ных молекул все еще остается некое распределение по значениям т, и если это распределение не является симметричным относительно нуля, то среднеседиментационный минимум не обязательно будет соответствовать тому количеству связанного красителя, которое получается из уравнения (24.3). [c.400]

Для осуществления комплементарного копирования цепей двух цеп очечная ДНК должна постепенно рас1фучиваться. Раскручивание, или расплетание, спирали происходит только в локальном участке репликативной вилки. Расплетание—это не спонтанный процесс, в нем участвуют белки двух типов (рис. 2.21). Одни из них, называемые ДНК-гелика-зами, используют для разделения цепей энергию, высвобождающуюся при гидролизе АТР до АОР. Геликазы часто функционируют в составе комплекса, осуществляющего перемещение репликативной вилки и репликацию расплетенных цепей (разд. 2.1). Вообще говоря, для расплетания достаточно одного геликазного белка, но для того, чтобы максимизировать скорость раскручивания, несколько геликаз могут действовать совместно. Белки второго типа, дестабилизирующие спираль,— это белЕИ, связывающиеся с одвоцепочечными участками и тем самым стабилизирующие расплетенный дуп-лею . Итак, геликазы вызывают локальное раскручивание двойной спирали, а другие специфические белки тотчас связываются с образовавшимися одноцепочечными участками, обеспечивая условия для комплементарного спаривания. [c.82]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология