Центрифугирование в градиенте плотности sl

Осторожным наслаиванием растворов сахарозы с последовательно уменьшающейся плотностью или центрифугированием растворов, содержащих кроме исследуемых веществ равномерно распределенные по объему пробирки соли цезия или рубидия, можно создать градиент плотности растворителя по высоте пробирки. Центрифугирование в ячейках с градиентом плотности приводит к накоплению вещества в очень узкой области, в которой плотность вещества совпадает с плотностью растворителя. Центрифугирование в градиенте плотности применяется, в частности, при изучении нуклеотидов. [c.157]

Фракционирование белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы основано на различии в скорости седиментации молекул, пропорциональной их молекулярной массе. Фракции РНК, обладающие различной молекулярной массой, после центрифугирования распределяются в линейном градиенте концентрации сахарозы при этом благодаря значительной вязкости растворов сахарозы улучшается разделение и уменьшается возможность смешивания различных фракций. [c.172]

Для грубого предварительного разделения клеточных фрагментов достаточно кратковременного последовательного центрифугирования при нескольких разных скоростях (с разным центробежным ускорением) (разд. 3.1. а). Однако, чтобы получить максимально чистые препараты органелл или молекул, используют центрифугирование в градиенте плотности. Например, для разделения РНК на несколько фракций, различающихся по константам седиментации, сначала в пластмассовой центрифужной пробирке создают градиент концентраций раствора сахарозы (от 25% на дне до 5% на поверхности). Затем сверху аккуратно наслаивают препарат РНК и проводят центрифугирование с очень высокой скоростью в течение нескольких часов. Препарат РНК разделяется на ряд медленно седиментирующих резких полос, стабилизируемых градиентом сахарозы. Затем пробирку прокалывают снизу и собирают фракции по каплям в пробирки с помощью коллектора фракций. Далее определяют положеиие каждой фракции и содержание в ней РНК. [c.163]

При достаточно большом времени центрифугирования частицы достигают в градиенте плотности равновесных положений. Именно та-[ким образом в соответствии с их плотностью в градиенте сахарозы разделяют клеточные органеллы (гл. 1, разд. Б.6). Макромолекулы (на- [c.163]

Следует также упомянуть метод центрифугирования в градиенте плотности. Обычно работают в возрастающем градиенте плотности сахарозы при высокой скорости ротора. Расстояние, на которое перемещается белок в градиенте, обратно пропорционально его молекулярной массе. Молекулярную массу неизвестного белка с достаточной точностью можно определить, сравнивая его с добавленным стандартным белком известной молекулярной массы. [c.361]

Использование золей кремнезема в качестве среды для получения градиента плотности при разделении клеток и других биологических компонентов методом центрифугирования рассматривалось в гл. 4. Кроме того, при проведении биологических исследований кремнезем может применяться в качестве носителя нли подложки культуральной среды. Такую кремнеземную подложку можно стерилизовать предварительной автоклавной обработкой, а при необходимости ее можно изготовлять в очень чистой форме, свободной от других неорганических или органических загрязнений. [c.1089]

Если подобрать состав растворителя и центробежное ускорение (л х так, чтобы плотность среды была равна плотности полимера в некоторой средней точке кюветы, то все макромолекулы должны стремиться собраться в сечении х=х , для которого Архимедов фактор полимера 1— Ур = 0. В этом сечении сила, действующая на макромолекулы, равна нулю. В части кюветы, где X < Жц, макромолекулы движутся по силовым линиям, т. е. вдоль радиуса. В той части кюветы, где х > Хц, плотность макромолекул меньше плотности растворителя и они всплывают, т. е. движутся по направлению к центру ротора, пока не достигнут точки Х=Х( где должны остановиться. Следовательно, в градиенте плотности центрифугирование делит макромолекулы не по молекулярным весам, а по плотностям или удельным объемам. При этом речь идет [c.169]

Рис. 51. Картина стационарного распределения концентрации (а) и градиента концентрации (б) в кювете ультрацентрифуги при центрифугировании в градиенте плотности.

В настоящее время метод центрифугирования в градиенте плотности получил широкое распространение. [c.172]

Весьма перспективным для количественной характеристики композиционной неоднородности представляется центрифугирование в градиенте плотности [143 144, с. 418]. Метод позволяет, в принципе, найти функцию композиционного распределения. Но однозначная интерпретация данных центрифугирования в градиенте плотности требует преодоления больших экспериментальных трудностей [145, 146], поэтому этот метод применяют редко [142, 147, 148]. [c.152]

При сопоставлении экспериментально найденных параметров композиционной неоднородности с величинами, рассчитанными на основе теории сополимеризации, обнаруживаются значительные расхождения. Так, для сополимера стирола с метилметакрилатом с теоретическим значением дисперсии композиционного распределения л 10 центрифугирование в градиенте плотности дает величину дисперсии 10 а светорассеяние — в зависимости от методики измерений — от 10"3 до 10 [142]. [c.152]

Выделение субклеточных частиц Дифференциальное центрифугирование, центрифугирование в градиенте плотности, зональное центрифугирование 9, 10 [c.66]

Седиментация под влиянием центрифугирования происходит при скорости, зависящей от размера капель эмульсии. Пинтер и Зильвесмит (1962) фракционировали эмульсии М/В по размерам частиц седиментацией в колонке с сахарозой. Они получали слои с различными плотностями. Градиент плотности создавали при смешивании 50 и 30% растворов сахарозы. Смесь помещали в пробирку емкостью 100 и далее вводили 1 мл эмульсии М/В в 50% растворе сахарозы. В нижнюю часть пробирки вводили 5 мл 60% раствора сахарозы. Центрифугирование проводили при скорости до 2800 об1мин. [c.153]

Фракция ДНК, содержащая высокоповторяющиеся геномные последовательности, включает, по-видимому, функционально и в значительной степени структурно обособленную часть генома, представленную сатяллитными ДНК. Сателлитные ДНК обладают характерным нуклеотидным составом и, следовательно, плотностью, отличающейся от валового нуклеотидного состава тотальной ДНК-Поэтому их удается в ряде случаев отделить от основной массы ДНК центрифугированием в градиенте плотности СзО (рис. 108, а). Отдельные фракции сателлитных ДНК могут составлять до 10 % от общего содержания ДНК, как, например, один из сателлитов-генома мыши. В составе одного генома можно обнаружить несколько разных сателлитных ДНК- [c.188]

В основе одного из первых механизмов, предложенных для объяснения генетической рекомбинации, лежало предположение, что рекомбинация непосредственно связана с синтезом ДНК. Согласно этому механизму выбора копии , репликация протекает вдоль одной из цепей ДНК до какой-то случайной точки, в которой полимераза перескакивает на вторую из двух гомологичных хромосом и начинает копировать ее. Согласно этому механизму, вновь образованная молекула ДНК будет частично комплементарна одной родительской двухцепочечной молекуле ДНК, а частично — другой. Чтобы проверить правильность этого предположения, Меселсон и Вейгле [220] заражали Е. oli двумя штаммами фага содержащими ДНК, меченную стабильными изотопами соответственно углерода ( С) и азота ( N). Центрифугирование в градиенте плотности показало, что рекомбинантная ДНК содержала как С, так и N. Таким образом, стало ясно, что в рекомбинант- ную ДНК потомства включается ДНК обоих родителей. Этот результат не подтвердил гипотезы выбора копии и свидетельствовал в пользу механизма, предполагающего, что рекомбинация сопровождается расщеплением цепей. [c.282]

Пря улыпрацентрифугировании для разделения используется седиментация, зависящая от размера, плотности и формы молекулы белка. Центрифугирование в градиенте плотности (зональное центрифугирование) часто применяется для разделения белков, а также для разделения органелл и вирусов. Одной из характеристик белка служат данные седиментационного анализа в ультрацентрифуге (разд. 3.5.4). Положение возникающих белковых зон можно наблюдать с помощью оптических методов. [c.349]

Денатурация нуклеиновых кислот сводится к разрушению двойной спирали (ДНК) илп двуспиральных участков (РНК). Нагревание раствора нативной ДНК вызывает разделение двойной спиралп па две цени, сворачивающиеся в статистические клубки, Нри этом значительно уменьшаются вязкость и оптическая активность, исчезает гипохромизм, т. е. возрастает интенсивность поглощения в области 260 нлг. Разделение на две цепи непосредственно доказывается центрифугированием ДНК, содержащей N, в градиенте плотности s l (ср. с. 82). Клетки Е. сой, выращенные в среде, содержащей i, переносились в среду с обычным N. При делении клеток образовывались редуплицированные двойные спирали, в которых одна цепь содержала N, другая — N. До денатурации наблюдался один пик плотности 1,717 г/см отвечающий двойным спиралям N — N. После денатурации появляются два пика — 1,740 и 1,724 г/см , отвечающие одноиптчатым клубкам соответственно с и., с 4, Плотность повышается, так как клубки более компактны, чем спираль. М. м. ДНК уменьшается при денатурации вдвое. Образование клубков наблюдается в электронном микроскопе. [c.233]

Нагревание раствора нативной ДНК при некоторых значениях pH и ионной силы вызывает разделение двойной спирали на две цепи, сворачивающиеся в статистические клубки. При этом значительно уменьшаются вязкость и оптическая активность, исчезает гипохромизм, т. е. возрастает интенсивность полосы поглощения в области 2600 А (см. стр. 498) [75]. Разделение на две цепи непосредственно доказывается центрифугированием ДНК, содержащей в градиенте плотности СзС (см. стр. 153). Клетки Е. соН, выращенные в среде, содержащей переносились в среду с обычным При делении клеток образовывались редуплицированные двойные спирали, в которых одна цепь содержала N , другая — До денатурации наблюдался один пик плотности 1,717 г/см , отвечающий двойным спиралям —N . После денатурации появляются два пика, а именно 1,740 и 1,724 г/см , отвечающие однонитевым клубкам соответственно с и Плотность повышается, так как клубки более компактны, чем спираль [76]. Прямые определения молекулярного веса ДНК показывают, что при денатурации он уменьшается вдвое [75, 77]. Образование клубков при денатурации непосредственно наблюдается в электронном микроскопе (рис. 8.15). [c.507]

Особенно интересна возможность установить характер распределения нуклеотидов по цепи путем исследования перехода спираль — клубок. Установлено, что ДНК ряда умеренных фагов содержит области, различаюш,иеся по концентрации пар Г — Ц [107]. Это отражается в появлении ступенек на кривой плавления и в распределении фрагментированных молекул ДНК при центрифугировании в градиенте плотности. Такую блочную гетерогенность можно исследовать путем параллельного изучения кривых плавления и зависимости характери( тичеСкой вязкости от Г в области перехода [107]. [c.515]

Для идентификации гена, кодирующего протоксин, используют обычную методику. В. thuringiensis выращивают в культуре и лизируют клетки. Выделяют суммарную клеточную ДНК и центрифугируют ее в градиенте плотности s l, чтобы разделить плазмидную и хромосомную ДНК. Если гены протоксинов входят в состав генома, создают банк клонов хромосомной ДНК. Если же они содержатся в плазмиде, то плазмидную ДНК фракционируют по размерам центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Это обогащает ту плазмидную фракцию, которая послужит в дальнейшем исходным материалом для идентификации генов протоксинов (рис. 15.3). [c.335]

Ген протоксина В. thuringiensis subsp. kurstaki находится на одной из семи плазмид длиной 2,0 7,4 7,8 8,2 14,4 45 и 71 т. п. н. Чтобы определить, в какой именно, проводили центрифугирование плазмидной ДНК в градиенте плотности сахарозы. Были вьщелены три фракции, в кото- [c.335]

Обычно миелин получают гемогенизацией нервной ткани с последующим фракционированием посредством центрифугирования в градиенте плотности. Его плотность составляет 1,08 г/мл, что позволяет применять изопикнические методы. Данные анализа, полученные различными исследователями, отличаются причиной могут быть примеси аксональной мембраны. [c.99]

В то время как электрофизиологи работают с интактным синапсом, биохимики пытаются выделить его функциональные субструктуры посредством контролируемого разрушения и последующего фракционирования методом центрифугирования в градиенте плотности. Примерами таких суб- , , и -I. I структур являются синаптосо- с ]с сщ — оторванные от аксонов и [c.190]

ДНК Колориметрический анализ (реакция с дифениламином) Центрифугирование в градиенте плотности (се-диментацнонное поведение) 2 [c.574]

Используя соответствующую соль, можно создать устойчивый в условиях центрифугирования градиент ее концентрации, а тем самым и градиент плотности растворителя. Если природа соли и распределение ее концентрации таковы, что плавучая плотность биополимера выше, чем плотность растворителя на мениске, но ниже, чем у дна пробирки, то по мере перемещения к дну пробирки биополимер достигнет участка, где множитель 1 - / о/р станет равным нулю и дальнейшая седиментация прекратится, т.е. возникнет устойчивая зона нахождения биополимера. Наиболее широкое применение для этой цели нашли растворы солей цезия, которые позволяют получить растворы с плотностью, достаточной для остановки перемещения нуклеиновых кислот. Эксперименты подобного рода весьма дороги, так как требуют длительной, обычно на протяжении нескольких суток, работы ультрацентрифуг. Однако они открывают некоторые уникальные возможности. Например, удается разделить биополимеры, различающиеся лишь изотопным составом. Молекулы ДНК из одного вида микроорганизма, выращенные на средах, содержащих в качестве источника азота соли аммония и 15NH4, не отличаются по объему, но имеют разные массы и, следовательно, различные плавучие плотности. Поэтому при равновесном центрифугировании и градиенте плотности хлорида цезия они образуют отдельные зоны. Пример применения этого метода для доказательства полуконсервативного характера репликации ДНК приведен в 5.1. [c.244]

Для этой цели в 1ТЬследнее время стали применять метод центрифугирования в градиенте плотности, дающии сведения о распределении полимеров не только по молек улярной массе, но и по химическому составу (см. ниже). [c.541]

Важной разновидностью седимеита-ционного метода, получившей широкое применение при исследовании природных полимеров, является центрифугирование в градиенте плотности [3, с. 418]. В центрифужной пробирке создают градиент плотности (например, смёшивая при помоши автоматически действующих насосов водный раствор сахарозы с водой в постепенно уменьшающихся соотношениях), а затем наслаивают поверх него исследуемый раствор полимера в легком растворителе (рис. 169). [c.544]

Метод центрифугирования в градиенте плотности был изобретен впервые Линдерштрём-Лангом. К изучению нуклеиновых кислот в водных растворах его с успехом применили Месельсоп, Сталь и Виноград [26]. Для линейных полимеров в органических растворителях его впервые разработали Бреслер, Нырков и [c.171]

Особым случаем равновесного центрифугирования является седиментация при градиенте плотности [14, 76, 135], для которой применяют двухкомпонентные системы растворителей. Градиент плотности возникает вследствие седиментационного разделения составных частей растворителя вещества с различной плотностью распределяются в различных точках, где их эффективная плотность равна плотности окружающей среды. Вследствие диффузии в этих полосах накопления зависимость с от г в идеальном случае подчиняется закону Гаусса. Чаще всего этот метод применяли для исследования нуклеиновых кислот, но можно получить распределение в градиенте плотности и для полимеров умеренного молекулярного веса, если в качестве растворителей брать смеси 1,2-дибром-1,2-дифторэтана с циклогексаном и использовать оптическую шлирен-систему [221. Другая система описана Бреслером и сотр. [30]. Сведения о распределении сополимеров по составу можно получить также путем измерения рассеяния света[33]. [c.61]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология