Мутации температуро-чувствительные

Первый тип-это температурочувствительные мутанты (ts). Боль-щинство фагов способно инфицировать хозяина и размножаться в широком интервале температур. Температурочувствительные мутанты многих фагов Е. соИ способны размножаться при 30°С (пермиссивные условия), но теряют эту способность и обнаруживают свой мутантный фенотип при температуре 40-42°С (непермиссивные условия). При такой температуре негативные колонии не образуются. Известны также мутанты, чувствительные к холоду ( s). Появление температурной чувствительности почти всегда свидетельствует о том, что в каком-то участке ДНК, кодирующем некоторый белок, произошла мутация, повлекшая за собой аминокислотную замену. В результате белок становится нестабилен при непермиссивной температуре и утрачивает активность. [c.194]

ГО полипептида или некоторой его части. Воздействие других мутаций на организм связано с аминокислотными заменами в полипептидной цепи, кодируемой данным мутантным геном (рис. 10.12). Аминокислотные замены могут, в частности, затрагивать и функционально важные аминокислотные остатки, а также вызывать заметные искажения пространственной структуры. В зависимости от того, насколько сильно эти искажения сказываются на структуре функционально важных участков, может наблюдаться снижение и даже полное исчезновение ферментативной или какой-либо иной функциональной активности белка. Мутации, чувствительные к температуре, могут быть связаны с аминокислотными заменами на участке, существенном для стабилизации вторичной и третичной структуры данного белка. Нормальная конфигурация, присущая при пермиссивной температуре мутантным полипептидам этого типа, при переходе в область рестриктивных температур может подвергнуться существенным искажениям. [c.28]

Культивирование Е. еоИ (X I N 0 ) при 42°С приведет к инактивации репрессора и соответственно транскрипции генов N и его. Мутации N и О" предотвратят протекание II стадии транскрипции и репликации ДНК. Таким образом, лизогены не погибнут. Транскрипция гена его обеспечит наработку белка его, который, связываясь с участком Or, будет ингибировать трансляцию гена с/ . Такое состояние транскрипции должно поддерживаться при возвращении культуры к температуре 30 С. Клетки будут чувствительны к инфекции фагом X, поскольку экспрессия гена его препятствует экспрессии гена с/ , продукт которого необходим для установления иммунитета. Это состояние транскрипции, по всей видимости, не абсолютно стабильно и может спонтанно переключаться в режим с/-включен, сто-выключен . [c.288]

Рассейте штамм NK337 до отдельных колоний, проверьте его температурочувствительность. (Чувствительность к температуре свидетельствует о наличии профага с мутацией 2ts.) Чувствительность к температуре проверяют, сравнивая эффективность образования колоний при 30 и при 42°С. [c.67]

У вирусов бактерий (бактериофагов) были получены мутации нескольких типов. Мутантный фаг, как правило, отличается от фага дикого тина спектром литического действия (круг возможных хозяев) или морфологией стерильных пятен. Недавно были обнаружены другие мутанты (так называемые условно летальные)-, отбор этих мутантов основан на их чувствительности к повышенной температуре (такие ts-мутанты способны расти, скажем, при 30, но не при 40°) или на их способности размножаться в клетках какого-то одного определенного типа и неспособности размножаться на близкородственных бактериальных штаммах. Мутанты этой последней группы называются ашЬег-мутантами или просто ат-мутантами. Было показано, что у фагов Т2 и Т4 как мутации ат, так и мутации ts локализованы в различных участках хромосомы. Известно, что эти участки контролируют синтез не только обычных фаговых белков, но и других белков, которые вырабатываются зараженной бактериальной клеткой и необходимы для синтеза компонентов фага, в особенности его ДНК. Анализ всех этих мутантов позволил построить детальные генетические карты для нескольких вирусов бактерий. [c.487]

За 15 лет, прошедших с тех пор, как впервые удалось выделить мутантные фаги ruh, было идентифицировано много других мутантов Т-четных фагов. С помощью этого набора мутантов оказалось возможным настолько повысить разрешающую способность генетического анализа, что в конце концов удалось заполнить разрыв между химией ДНК и структурой гена (гл. XIII). Тем не менее стало ясно, что все эти мутации затрагивают только относительно малую часть всего генома фага. Причина этого совершенно очевидна большинство генов фага, несомненно, кодируют белки, осуществляющие жизненно важные функции, так что мутации по этим генам неизбежно должны быть летальными. Несмотря на очевидность этого обстоятельства, долгое время никому не приходило в голову применить к Т-четным фагам остроумный метод, разработанный Горовицем и Лейпольдом для нолучения мутантов по жизненно важным генам Е. oli. Этот метод состоит в отборе чувствительных к температуре мутантов (см. гл. V). Наконец, в 1960 г. Эдгар и Эпштейн выделили /s-мутанты фага Т4, которые совершенно не образуют стерильных пятен при 42 °С, но образуют их при 25 °С. В то же время штамм дикого типа T4/s образует стерильные пятна при обеих температурах одинаково хорошо. Изучение физиологии размножения /х-мутантов при повышенной, запрещающей температуре показало, что у разных мутантов блокированы разные стадии развития фага. Так, у /s-мутантов одного класса при запрещающей температуре репликация фаговой ДНК не может начаться вследствие того, что при 42 °С у них не могут функционировать те или иные ранние ферменты, участвующие в метаболизме нуклеотидов — предшественников ДНК у /s-мутантов другого класса при запрещающей температуре синтез ДНК начинается, блокируются же более поздние стадии. Возникают, например, мутации в гене, кодирующем фаговый лизоцим. Бактерии, зараженные такими мутантами, не лизируют при 42 °С, хотя и содержат инфекционные частицы потомства фага. Были также найдены мутации во многих генах, кодирующих структурные компоненты фага в бактериях, зараженных любым из таких мутантов, при 42 °С не происходит сборки целых частиц зрелого фага. В этом случае лизаты содержат различные типы недостроенных компонентов фага. Если мутация затрагивает ген, кодирующий белок головки фага, лизат, полученный при высокой температуре, содержит целые фаговые отростки, но не содержит головок. Когда мутация затрагивает ген, кодирующий фибриллы отростка, у почти завершенных фаговых частиц имеется головка и присоединенный к ней отросток, но отсутствуют фибриллы, необходимые для присоединения к клетке-хозяину. [c.283]

Представление о бессмысленных кодонах объясняет также наблюдения, описанные в гл. XIII, относительно внутригенной комплементации мутантов по ферментам, состоящим из нескольких субъединиц если чувствительные к температуре мутанты (/s-мутанты), у которых мутации локализованы в генах соответствующих ферментов, способны к внутригенной комплементации, то у мутантов по тем же самым генам этого явления никогда пе наблюдалось. Действительно, в отличие от гомологичных полипептидных цепей s-мутантов, содержащих аминокислотную замену, неполные цепи, образующиеся при заражении непермиссивного хозяина атЬег-мутантами, вероятно, не могут объединяться друг с другом, образуя при этом каталитически активную четвертичную структуру белка. [c.453]

Биохимические исследования жизненного цикла бактериофагов семейства 2 были в значительной степени дополнены работами по выделению и исследованию фаговых мутантов. Эти мутанты относились в основном к тем же двум условно-летальным типам, которые были использованы при построении кольцевой генетической карты Т-четных фагов а) чувствительные к температуре ( т ззеп5е ) мутанты, неспособные размножаться при повышенной температуре, при которой происходит развитие фага дикого типа, и б) ат6ег(нонсенс)-мутанты, способные размножаться только в клетках штаммов, несущих супрессорную мутацию, обеспечивающую-включение приемлемой аминокислоты в растущую полипептидную цепь под влиянием мутантного бессмысленного кодона УАГ (УАА или УГА). [c.474]

В таблице 7.2 перечислены 39 условно летальных мутаций фага фХ174 все они лишают фаг способности к размножению при инфицировании в непермиссивных условиях. Для того чтобы определить, влияют ли две независимо возникшие мутации на одну и ту же генетическую функцию или на разные, можно использовать комплементационный тест, описанный в предыдущей главе. Бактериальные клетки одновременно заражают фагами обоих мутантных типов при непермиссивных условиях, например при температуре 42°С, если оба мутанта чувствительны к температуре. Если в таких дважды инфицированных бактериальных клетках потомство фагов возникает, можно сделать вывод, что каждый фаг осуществляет функцию, которую не может осуществить другой (см. рис. 6.6). Такие две мутации называются комплементарными и относятся к разным генам. Выполняемый таким образом тест на комплементацию полностью аналогичен описанному в гл. 6 для мутантов эукариот. Возникает как бы диплоидная инфицированная клетка, в которой хромосома каждого фага несет по одной мутации, и наблюдается диплоидный фенотип, т. е. потомство фага либо возникает, либо нет. Заметим, что для выполнения теста на комплементацию нам не надо определять генотип фагового потомства. [c.195]

Известны температурочувствительные мутации гена su3 Е. соН. Предложите метод обнаружения таких мутаций. По аналогии с известными температурочувствительными белками предложите интерпретацию феномена чувствительности к повышенной температуре этих тРНК -мутантов. [c.102]

Для идентификации вирусных онкогенов используются различные методики. Удобным генетическим подходом является получение мутаций в онкогене, ведущих к его инактивации при повышенной температуре. У таких температурочувствительных мутантов можно включать или выключать данный ген, просто повьппая или понижая температуру. При более низкой температуре (34°С) чувствительные клетки, содержащие вирусный онкоген, будут обладать опухолевым фенотипом и, например, расти в отсутствие некоторых факторов, в которых они нуждались ранее (табл. 11-1). Если затем экспрессию онкогена подавить, повысив температуру до 39°С, то клетки быстро (обычно через несколько часов) вернутся к нормальному фенотипу (рис. 11-15). Подобный цикл изменений фенотипа можно повторять многократно. Эти изменения доказывают, что температурочувствительный ген вируса-это и есть ген, ответственный за неопластическую трансформацию клеток, и, следовательно, его можно считать онкогеном. [c.153]

Даже замена одной аминокислоты на другую в результате так называемых миссенс-мутаций, сильно нарушает стабильность белков. Применение иммунологических методов показало, что около половины таких мутаций, полученных в гистидиновом опероне. S. typhimurium, приводят к деградации мутантных ферментов. Оказалось также, что у многих температурно-чувствительных мутантов утрата функции при повышении температуры связана с протеолизом измененных белков. [c.52]

Повышая стабильность дефектных белков, мутация Ion частично супрессирует температурно-чувствительную делецион-ную мутацию rpoD800, повреждающую основную сигма-субъеди-ницу РНК полимеразы Е. соИ. Клетки, несущие эту мутацию, растут при температуре 30°С, но не могут расти при 41,5 С, очевидно, в связи с деградацией поврежденного белка. Двойные мутанты RpoD800Lon развиваются при указанной температуре, хотя в отличие от бактерий дикого типа не способны к росту при 43 С. [c.54]

Для инъецирования своей ДНК в бактериальную клетку фагу Р22 необходим кальций. ЭГТА образует комплексы с кальцием и тем самым препятствует размножению фага. В данном эксперименте выход чувствительных к фагу трансдуктантов повышается в результате того, что предотвращены повторные циклы развития фага на чашке. Предадсорбция необходима, чтобы фаговая ДНК могла быть инъецирована до-того, как клетки окажутся на чашке с ЭГТА. Используемый фаг несет мутацию 2ts, так что высокая температура препятствует установлению репрессии. Поэтому чашки, на которые высевается трансдукционная смесь, инкубируют при 40°С. [c.22]

Через 48 ч должен вырасти штрих на чашке, инкубируемой при 30°С. На той чашке, которая инкубировалась при 40°С, на месте штриха должно быть лишь несколько больших колоний. Это и есть искомые Hfr-клетки. Они являются La ft при той температуре (40°С), при которой невозможна автономная репликация эписомы F 1ас+. Как предполагается, гены 1ас+ эписомы F, встроившись в хромосому, перестали быть чувствительными к температуре. Уколом отберите несколько таких предположительных Hfr-клеток и вырастите их культуры в жидкой селективной среде (N E + 0,5% лактозы) при 40°С. Также посейте в LB (при 37°С) культуры ряда реципиентов, которые будут использоваться для картирования. Это единичные ауксотрофы, каждый из которых несет также мутацию устойчивости к стрептомицину. Нужно немного таких штаммов. Поэтому можно рискнуть и приготовить один набор реципиентных культур сразу на несколько групп. Чтобы сэкономить чашки, можно и контрольные чашки с реципиентами приготовить сразу на несколько групп. [c.55]

Вполне вероятно, что общий механизм чувствительности к холоду, которая появляется в результате мутаций генов,-кодирующих рибосомные белки, а также генов, кодирующих регуляторные ферменты, связан с требованием точной конформации белков обоих классов. К изменениям конформации приводит, по-видимому, ослабление гидрофобных связей при низких температурах (Brandts, 1967). [c.113]

На основе этой общей стратегии вы разрабатываете схем) отбора клеток, мутантных по механизму ядерного транспорта и чувствительных к температуре (ts). Вы хотите найти мутанты, которые хорошо растут при низкой температуре (разрешающи условия), но плохо-при высокой температуре (ограничивающи условия). Вы планируете индуцировать мутации в клетках с плазмидой pNL" при низкой температуре, а затем перевести ш в условия высокой температуры и среду с галактозой. Ви считаете, что при ограничивающей температуре мутанты по ядер ному транспорту не будут поглощать белок-убийцу, кодируемы плазмидой pNL" , а потому не погибнут. В нормальных же клетка будет происходить транспорт белка-убийцы в ядро, и они ногиб нут. После инкубации в течение 1-2 ч при высокой температуре, з время которой нормальные клетки должны погибнуть, вы намере ваетесь понизить температуру и поместить выжившие клетки н пластинки питательного агара, содержащего глюкозу. Вы полага ете, что мутанты по ядерному транспорту реактивируются пр низкой температуре и дадут колонии. [c.106]

DGGE — денатурирующий градиентный гель-электрофорез. В этом методе ДНК-дуплексы подвергаются миграции в геле с градиентом денатурирующих условий (может быть использован и температурный градиент). Мифация продолжается до тех пор, пока ДНК-дуплексы не достигают в геле точки плавления и не разделяются, после чего миграция фрагментов останавливается. Однонуклеотидные различия в нормальной и тестируемой ДНК выявляются по различной электрофоретической подвижности в геле. Высокая чувствительность метода (95%) достигается благодаря специфическим праймерам с так называемым G -зажимом, представленным чередованием гуанина и цитозина в количестве до 20 нуклеотидов. За счет этого температура плавления продукта амплификации сильно увеличивается, что повышает эффективность определения мутации. Однако праймеры с ОС-зажимом достаточно дороги, поэтому метод используется ограниченно. [c.267]

Мутации у бактерий обнаруживаются по изменению любого известного признака микроорганизма (например, способность синтезировать аминокислоту, чувствительность к антимикробным препаратам и др.). Существуют различные типы мутаций. По происхождению мутации могут быть спонтанными или индуцированными. Первые возникают без вмешательства экспериментатора, вторые — в результате воздействия мутагенов на бактериальную популяцию, т. е. физических, химических или биологических факторов, способных вызывать мутацию. К мутагенам относятся различные виды радиации, температура, ряд химических соединений (нитраты, нитриты, бромурацил, 2-аминопурин, нитрозогуанидин и др.). Частота спонтанных мутаций в среднем равна 10" . [c.87]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология