Футпринтинг

Рис. 9-67. Некоторые стабильные комплексы, образуемые факторами транскрипции с эукариотическими генами. Черным цветом обозначены определенные последовательности ДНК, которые, как полагают, необходимы для функционирования промоторов У каждого гена цветом выделены области, которые закрываются" присоединившимися факторами (на основании данных футпринтинга ДНК, см. рис. 4-69). Факторы транскрипции представляют собой молекулу белка, которая, вероятно, состоит из нескольких субъединиц, хотя доподлинно строение этих факторов неизвестно. Цифрами обозначено положение на молекуле ДНК (в нуклеотидных парах) относительно сайта начала гранскрипции,

Дополнение 14.2. Футпринтинг - метод изучения ДНК-белковых взаимодействий [c.156]

Рис. 14.15. Локализация сайтов связывания интегразы фага X с участком POP с помощью метода футпринтинга . Аликвоты, содержащие рестрикционный фрагмент, 5 -конец одной из цепей которого помечен Р, подвергали частичному расщеплению неокарциностатипом (расщепляет по А и Т) в присутствии и в отсутствие интегразы или гепарина. Набор образующихся фраг-МЬнтов анализировали с помощью гель-электрофореза (три левые дорожки). В двух правых дорожках — фрагменты, образующиеся при расщеплении того же меченого фрагмента по пуриновым или по пиримидиновым нуклеотидам методом Максама — Гилберта, для идентификации участков последовательности, защищаемых интегразой. (По Hsu Р. L,

Связывание очищенного димера с1 с изолированной ДНК О к изучали с помощью метода футпринтинга . Таким образом удалось оценить относительные [c.189]

Сго образует стабильный димер, и нет никаких данных, что он состоит более чем из одного домена об этом же свидетельствуют результаты рентгеноструктурного анализа (рис. 2.9). Эксперименты по футпринтингу показывают, что Сго связывается некооперативно с тремя участками Or и с тремя участками Ol- По сродству к Сго участки Or располагаются в порядке, указанном на рис. 1.23, т.е. Or3 > 0 2 = Or 1, а участки Ol-b порядке Ol 1 > Ol 2 = ( l 3. В 0,2 М K l при 37°С Сго связывается с Or 3 так же прочно, как димер репрессора с Or 1. Сродство Сго к Or 2 и Or 1 примерно на порядок ниже, чем к Or3. [c.117]

Пока не определена трехмерная структура белков этого типа, и, следовательно, остается неизвестным, как они связываются с ДНК. На рис. 9-10 представлена гипотетическая схема, которую подтверждают данные футпринтинга, [c.104]

Наряду с химической модификацией для тех же целей люжно использовать ферменты, катализирующие гидролиз нуг<лсиноных кислот. Например, в экспериментах по футпринтингу комплексов ДНК с белками часто используют панкреатическую дезоксирибонуклеазу (ДНКаза I), которая выделяется в пищеварительный тракт млекопитающих поджелудочной яселезой. Этот фермент катализируе г гидролиз внутренних фосфодиэфирных связей в двунитевых и однонитевых ДНК. При кратковременной обработке ДНК этим ферментом, проведенной так, чтобы в среднем на каждую молекулу ДНК пришелся одш разрыв, расщепление приводит к образованию фрагментов самой разнообразной длины, легко регистрируемых с помощью гель-электрофореза. При такой же обработке комплекса ДНК с белком расщепления в участках, экранирован 1ых белковой молекулой, не происходит и фрагменты соответствующей длины на электрофореграмме не обнаруживаются. На рис. 94 в качестве примера приведен результат исследования с помощью футпринтинга фрагмента ДНК с ферментом РНК-полимеразой (см. [c.324]

Рис. 15.17. Специфичность связывания репрессора с1 фага X с последовательностями Or 1, Or 2 и Or 3, оцениваемая с помощью футпринтинга (см. Дополнение 14.2). Расщепление ДНКазой I рестрикционных фрагментов, содержащих область Or и меченых Расщепление проводили в присутствии возрастающих концентраций репрессора. Концентрация репрессора дана в единицах мо-лярности (нМ) в расчете на 1 субъединицу репрессора. ( ourtesy of

Модификация метода секвенирования ДНК, представленная на рис. 4-66 и 4-67, может быть использована для выявления в ДНК последовательностей, опознаваемых ДНК-связывающими белками. Связывание этих белков с регуляторными участками ДНК (которые обычно локализованы вне кодирующих участков генов), по-видимому, играет важную роль в определении того - какие именно гены активны в данном типе клеток. Понимание функции этих белков чрезвычайно важно для идентификации специфических последовательностей, с которыми они связываются. Для выявления таких последовательностей обычно используют метод, именуемый ДНК-футпринтинг. Сперва очищенный фрагмент ДНК метят по одному концу Р и затем расщепляют с помощью нуклеазы или химического соединения, делающего случайные разрезы в двойной спирали ДНК. Фрагменты, которые образуются из меченой цепи, разделяют на геле и выявляют на радиоавтографе после этого сравнивают расположение полос ДНК. образуемых в присутствии и в отсутствие ДНК-связываюших белков. Если связывание произошло, нуклеотиды в сайте расщепления оказываются защищен- [c.235]

Для того чтобы определить положение нуклеосом в клетках, нужно обработать их ферментом или реагентом, вносящим разрывы в ДНК, а затем изучить защищенные от воздействия участки методом, аналогичным футпринтингу ДНК (см. разд. 4.6.6). Хотя большинство нуклеосом. по-видимому, расположены случайным образом, известны поразительные примеры из неслучайного расположения. Так, у дрожжей Sa haromy- es erevisiae 15 нуклеосом строго фиксированным образом окружают ДНК центромеры (последовательность EN) (разд. 13.5.3). Единственный сайт локализации имеет и нуклеосома, связанная с очень маленьким по размеру геном 5S-pPHK. Известно также, что по крайней мере одна нуклеосома расположена перед точкой начала синтеза РНК -глобина. [c.112]

РНК-полимеразы обычно состоят из нескольких полипептидных цепей и имеют мол. массу 500000 дальтон и более. У бактерий и эукариот эти ферменты эволюционно близки (рис. 9-64) В связи с тем, что бактериальный фермент изучать гораздо легче, его свойства послужили основой для понимания того, как функционирует аналогичный фермент эукариот. РНК-полимераза E. oli содержит пять субъединиц а, р,, Р, о и со, (по две копии а и по одной каждой из субъединиц). По нуклеотидной последовательности гена реконструирована полная аминокислотная последовательность каждой субъединицы, а данные футпринтинга ДНК свидетельствуют о том, что при соединении с ДНК фермент закрывает 60 нуклеотидных пар. [c.144]

Рис. 10-21. Сопоставление данных по активности мутантного энхансера, описанного на рис. 10-20, В с расположением сайтов связывания белков с нормальным энхансером. Цветные полоски на рисунке соответствуют частям нормальной последовательности энхансера. которые закрываются указанными белками. Эти данные получены при смешивании нормальной последовательности энхансера с экстрактами эритроцитов курицы и последующем анализе смеси методами электрофореза и футпринтинга. Активность выражена как процент активности энхансера цифра ШО означает, что данный мутант стимулирует синтез РНК также, как и нормальный энхансер 0-синтез РНК не превышает транскрипцию в отсутствие энхансера. Результаты показывают, что наибольший вклад в стимуляцию транскрипции энхансером дают белки АР1-подобный, АР2-подобный и ЕгуП, однако по отдельности ни один из этих белков не может обеспечить полноценную активность энхансера (рис 10-23).

Получить прямое доказательство того, что активированные рецепторы стероидных гормонов связываются со специфическими генами, было очень трудно, и это удалось сделать лишь в 1983г., когда была разработана технология рекомбинантных ДНК. Она позволила клонировать гены, регулируемые стероидными гормонами, и получать в больших количествах специфические последовательности ДНК Необходимо было еще очистить рецепторные белки, что само по себе является весьма трудоемкой и длительной процедурой. Как только удалось получить рецепторы в очищенном виде, связывающие их последовательности ДНК были картированы in vitro методом футпринтинга (разд. 4.6.6), оказалось, что присоединение рецептора защищает от мягкого расщепления нуклеазами или химическими реагентами фуппу специфических нуклеотидных последовательностей ДНК. Если эти короткие узнаваемые последовательности из гена удалить, то стероидный гормон уже не будет активировать его транскрипцию. Более того, если короткий фрагмент ДНК, который содержит узнаваемую последовательность, слить с другим геном (репортером) и затем перенести в клетку, содержащую рецепторный белок, то соответствующий стероидный гормон будет активировать транскрипцию гена-репортера. Эти эксперименты показывают, что последовательности ДНК, узнаваемые in vitro активированными рецепторами стероидных гормонов, действительно опосредуют действие рецептора в клетке. Гены, чувствительные к стероидным гормонам, как правило, содержат несколько групп узнаваемых последовательностей, обычно расположенных выше (а иногда и ниже ) кодирующей области где-нибудь внутри гена (рис. 12-10). Ввиду значительной структурной гомологии между разнообразными репепторами лля стероидных гормонов близкое сходство распознаваемых ими последовательностей не вызывает удивления. [c.350]

Весьма полезным методом изучения ДНК-белковых взаимодействий является так называемый футпринтинг (рис. 4.15). Некий белок, связанный с определенным участком ДНК, защищает его от расщепления, например, ДНКазой, которая в обычных условиях случайным образом вносит в ДНК одноцепочечные разрывы. На практике обычно вначале получают фрагменты ДНК, меченные по одному из концов одной цепи. Затем добавляют такое количество ДНКазы, чтобы внести в каждую молекулу в среднем не более одного разрыва, ДНК денатурируют и проводят гель-электрофорез. [c.102]

Рис. 4.15. ДНКазный футпринтинг. Продукты реакции выявляют с помощью радиоавтографии, поэтому немеченая ДНК не обнаруживается. После гель-электрофореза образуется лесенка из полос, каждая из которых соответствует цепочке ДНК, на один нуклеотид более длиной, чем в следующей ступеньке , если идти сверху вниз.

В экспериментах по ДНКазному футпринтингу репрессор защищает участок оператора длиной 17 пар оснований плюс еще по нескольку пар оснований с обеих сторон. Как видно из рис. 4.16, он защищает от метилирования под действием ДМС и звенья G в пределах оператора, но не вне его. На метилирование А репрессор не влияет, и это согласуется с представлением о гом, что он располагается в большом, а не в малом желобке оператора. [c.104]

Как показывают данные по связыванию с фильтрами и результаты футпринтинга, и репрессор, и Сго могут связываться с каждым из этих участков по отдельности. Оба белка защищают от метилирования звенья G, лежащие с одной стороны двойной спирали каждого из участков связывания (см. левую час1ь рис. 4.16). Кроме того, репрессор в отличие от Сго защищает один из двух звеньев G, лежащих с задней стороны двойной спирали примерно посередине каждого участка связывания. Ниже мы покажем, что в этих взаимодействиях с задней стороны спирали участвуют гибкие руки Х-репрессора. [c.105]

С помощью футпринтинга с применением ДНКазы или ДМС можно оценить сродство репрессора к каждому операторному участку. Эксперимент проводят при разных концентрациях репрессора, чтобы найти такую концентрацию, при которой половина этих участков занята и потому защищена от воздействия нуклеазы или какого-либо химического агента. Для изучения кооперативности таким методом используют ДНК с Or, содержащим один, два или все три операторных участка. [c.107]

Рис 4 18 Сродство участков оператора к интактному репрессору Числа указывают относительное количество димера репрессора, необходимое для защиты соответствующего участка до уровня, составляющего половину от максимального в экспериментах по ДНКазному футпринтингу Таким образом, эти числа пропорциональны константам диссоциации. Сродство соседствующих и искусственно разделенных сайтов различно (кооперативное и некооперативное связывание соответственно). Если вместо интактного репрессора использовать N-концевой домен, никакой разницы между кооперативным и некооперативным связыванием не наблюдается, [c.107]

Рис. 4.27. Расположение А.-репрессора на операторных участках 0 1 и Or2 и полимеразы на RM Боковая поверхность двойной спирали ДНК изображена в виде плоскости, чтобы показать все фосфаты, контактирующие с полимеразой в области и с репрессором в области 0 1 и 0 2. (Футпринтинг при участии ДНКазы показывает, что полимераза занимает более протяженный участок ДНК, чем можно судить по контактам е этими фосфатами. Мы всюду изображаем полимеразу с учетом этого факта.)

По данным футпринтинга максимальная активация под действием репрессора наблюдается при такой его концентрации, когда он заполняет только участки 0 1 и 0 2. При более высокой концентрации заполняется также 0 3, и RM подавляется. Если промотор содержит мутантные 0 1 и 2 или если мутантен только 0 2, никакой стимуляции под действием репрессора не наблюдается. Если мутантны 0 1 и Or 3. стимуляция RM возможна, но она происходит при более высокой концентрации репрессора, чем в случае интактного участка Or 1. Напомним, что, если Or 1 несет мутацию. Or 2 слабее связывает репрессор. Выделенный N-концевой домен репрессора также стимулирует Pr и in vivo, и in vitro в этом случае эффект не зависит от того, несет ли Or 1 мутацию. Напомним, что N-концевой домен связывается некооперативно. [c.128]

Поиск факторов транскрипции и их выделение из клеток человека и мыши основывается на двух аналитических подходах, обусловленных 1) способностью белковых факторов восстанавливать транскрипционную активность экстрактов, истощенных по факторам транскрипции 2) способностью таких факторов оставлять отпечаток (футпринт) на последовательности ДНК, с которой они связываются. Метод отпечатков (футпринтинг)-это универсаль- [c.30]

Гидролиэ рДНК млекопитающих, связанной с фактором транскрипции UBF-1, под действием ДНКазы I (футпринтинг). Для определения характера связывания UBF-1 со значащей и матричной цепями использовали соответственно сегмент промотора рДНК человека размером 297 п.н. (между парами оснований —199 и +78, меченный 5 - Р по остатку —199) и сегмент размером 525 п. н. (между парами оснований — 500 [c.31]

Полипептидные факторы транскрипции. Большое число факторов, предположительно участвующих в транскрипции ранней области SV40. было выделено из клеточных экстрактов, способных осуществлять транскрипцию с промотора ранней области. Для их идентификации, очистки и изучения применялись разные методы. Некоторые факторы специфически связываются с конкретным элементом, о чем свидетельствует их способность защищать определенные основания в этом элементе от расщепления ДНКазой 1 (футпринтинг разд. 8.2.в), а также уменьшение электрофоретической подвижности ДНК, содержащих такой элемент, при связывании его с белком (смещение полосы). Имеются данные о восстановлении транскрипционной активности в экстрактах, обедненных определенными факторами, при добавлении последних, а также об отсутствии такого восстановления в том случае, когда сайты связывания разрушены. Это указывает на то, что связывание данных факторов активирует транскрипцию. Клонированы и секвенированы гены, кодирующие некоторые факторы транскрипции. Их экспрессия в Е. соН и способность синтезированных продуктов активировать транскрипцию in vitro позволяют идентифицировать важные домены белков. [c.54]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология