Карбоксипептидаза белковыми ингибиторами

Карбоксипептидаза А катализирует гидролиз некоторых концевых пептидных связей в пептидах и белках и содержит один атом цинка в молекуле. Путем замены цинка на Мп + в фермент можно ввести парамагнитный зонд, при этом активность хотя и снижается, но не утрачивается полностью. Изменения эффекта парамагнитного усиления релаксации протонов воды показали, что связывание таких ингибиторов, как бромацетат, приводит к вытеснению молекулы воды из координационной сферы иона Мп +, соединенного с ферментом, что указывает на непосредственную связь между ингибитором и ионом Мп + [14]. Последующее изучение спектров ЯМР ингибиторов подтвердило гипотезу о прямом связывании с Мп + [15]. Однако для большинства ингибиторов не удалось определить расстояния из-за того, что т , с [уравнение (23.5)]. Несмотря на это, можно определить верхнюю границу возможных расстояний, полагая ЕсЛи и величины одного порядка, то можно, по крайней мере в принципе, измерить т , независимым путем,что позволяет затем рассчитать Условие 2т > 1,2га при исследованиях ферментов выполняется очень часто, так как (т. е. время жизни комплекса металл -фермент — лиганд) часто имеет порядок 10 с, что совпадаете типичными значениями для Т 2т- [c.389]

Вьщелено и изучено несколько десятков белковых ингибиторов, подавляющих активность трипсина, химотрипсина, карбоксипептидазы, калликре-ина, эластазы, плазмина и других протеолитических ферментов. Многие из них получены в гомогенном кристаллическом состоянии. Молекулярные массы ингибиторов белковой природы колеблются от нескольких тысяч до нескольких сотен тысяч, но в основном они представлены белками с молекулярными массами около 6000 Да. Многие из белков—ингибиторов ферментов—являются гликопротеинами. Гхервичная структура нескольких [c.93]

Рентгенографически исследованы структуры комплексов карбоксипептидазы с субстратом глицил-Ь-тирозином (рис. 6.11) и с ингибиторами, например с р-(п-иодофенол)-пропионатом [39]. У этого фермента кофактором служит атом 2п. Лиганды входят в полость молекулы белк и присоединяются в области, в которой [c.376]

Шульман н сотр. [ИЗ—115] исследовали активный центр карбоксипептидазы А путем измерения релаксации малых молекул, связанных с этим ферментом. Карбоксипептидаза является протео-литическим металлсодержащим ферментом, который катализирует расщепление С-концевой пептидной связи в пептидах и белках. Она имеет молекулярную массу 34600 и содержит 1 атом цинка на молекулу, который обусловливает каталитическую активность, но фермент остается активным при замене 20 + на ионы Мп + или Со2+ [116]. Кристаллическая структура фермента известна [117, 118]. С атомом металла координированы три белковых лиганда, и имеются свободные положения по меньшей мере еще для двух лигандов. Связывание растворителя (НгО) [ИЗ], ингибиторов [114] или фторид-иона [115] на активном центре Мп2+-фермента влияет на релаксацию связанных ядер не только потому, что белок имеет длинное время корреляции, но также вследствие наличия парамагнитного иона металла. Уширение резонансных сигналов растворителя было объяснено тем, что одна молекула воды связывается с ионом Мп2+. Как следует из измерения уширения пиков метильных или метиленовых протонов конкурирующих ингибиторов — индо-лилуксусной, г/7ег-бутилуксусной, бромуксусной и метоюсиуксус-ной кислот — и одновременного определения времен корреляции взаимодействия протонов ингибитора с металлом, релаксация определяется главным образом временем обмена комплекса белок — ингибитор. Используя известные константы Михаэлиса — Ментен и эти данные, можно определить константы скорости всех отдельных стадий реакции фермента с субстратом. [c.393]

Метод прост для выполнения, но требует тщательной очистки фермента малейшая примесь в нем каких-либо протеиназ (например, трипсина или хи.мотрипсина) резко искажает результаты. Поэтому в инкубационную среду обычно добавляют специфический ингибитор этих ферментов—диизопропилфторфосфат, не оказывающий какого-либо действия на карбоксипептидазу. Белок инкубируют в течение различных сроков с карбоксипептида-зой, фермент инактивируют, белки осаждают, а в безбелковом фильтрате количественно определяют отщепившиеся аминокислоты. Для каждой аминокислоты строят график увеличения ее содержания в безбелковом фильтрате во времени. Очевидно, что наибольшая интенсивность накопления должна быть для концевой аминокислоты, несколько меньшая для следующей и т. д. Таким образом, удается установить последовательность расположения в полипептидной цепи нескольких аминокислотных остатков (7—10) с С-конца. Метод был предложен Ленсом в 1949 г. [c.76]

В последнее время появилась возможность изучать физические свойства белков такими методами, как температурный скачок, которые позволяют исследовать процессы с временами, соизмеримыми с временами каталитического превращения субстрата на ферменте, так что стало возможным непосредственно установить взаимосвязь между скоростями субстратзависи-мых конформационных изменений и скоростями самой реакции. В настоящее время имеется ун е несколько свидетельств в пользу существования изомеризации ферментов и ферментсубстратных комплексов, которые могут представлять собой конформационные изменения такого рода [49—52]. Скорость мономолекулярной изомеризации глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы характеризуется константой порядка 1 с и является слишком медленной, чтобы этот процесс имел место при каждом обороте фермента по-видимому, этот процесс относится к явлениям контроля ферментативной активности. Рентгеноструктурный анализ лизоцима [28], химотрипсина [54] и карбоксипептидазы [55] дал прямое доказательство существования изменений в конформации фермента при взаимодействии с субстратами или ингибиторами. Гемоглобин, хотя и не является ферментом, но может быть поучительным примером использования всех этих методов для демонстрации конформационных изменений при взаимодействии этого белка с кислородом [56]. [c.243]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология