Конъюгат фосфатазой щелочной

В. Добавление конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза [c.200]

Конъюгат стрептавидин-щелочная фосфатаза [c.200]

ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛ С ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗОЙ [c.318]

Первым реагентом, использованным для синтеза иммуноферментных конъюгатов, был глутаровый альдегид, реагирующий с е-аминогруппами лизина белковых молекул. С помощью глутарового альдегида получены конъюгаты антител и антигенов с пероксидазой, щелочной фосфатазой, глюкозооксидазой, глюкоамилазой. Состав полученных конъюгатов можно варьировать, изменяя концентрацию альдегида и белковых компонентов. [c.109]

Синтез конъюгатов с применением глутарового альдегида разработан в основном для пероксидазы хрена, щелочной фосфатазы и глюкоамилазы. Недостатком метода является невысокий выход конъюгата (1—10%) и поляризация белков, в результате чего теряется иммунологическая активность. К достоинствам метода относится его простота и то, что качество получаемого конъюгата удовлетворяет необходимым требованиям. [c.184]

Синтез конъюгата IgG с щелочной фосфатазой с помощью глутарового альдегида (одностадийный метод). [c.184]

Синтез конъюгата щелочной фосфатазы с тироксином. [c.195]

ООО. Охарактеризованные таким образом препараты были использованы для определения активности антител к динитро-фенильным группам по отношению к ДНФ-желатине, иммобилизованной на поверхности лунок. Полученные результаты (рис. 14-10) согласуются с выводами о том, что сигмоидный характер кривой титрования в области высоких концентраций антител обусловлен пространственными затруднениями. Наибольшим сходством с кривой связывания первичных антител обладает кривая титрования конъюгата, имеющего состав [1 молекула Fab — 1 молекула щелочной фосфатазы]. [c.230]

Стабильность иммуноферментных конъюгатов при хранении— важнейший параметр, обусловливающий возможность их практического использования. Методы направленной стабилизации конъюгатов пока еще не разработаны. Не существует также корреляции между стабильностью конъюгатов и методом их получения. Однако вь1сокая стабильность гибридных молекул обеспечивает их применение на практике и значительно превосходит стабильность антител и антигенов, меченных радиоактивными изотопами. В лиофилизованном состоянии ферментные конъюгаты сохраняют свои свойства до двух лет. Стабильность при хранении в растворе (+4°С) более года отмечена для конъюгатов с щелочной фосфатазой, р-галактозидазой, лизоцимом, пероксидазой. [c.113]

Конъюгат [антитело — щелочная фосфатаза], содержащийся в избытке, катализирует образование окрашенного продукта прямо пропорционально концентрации фермента, причем эта зависимость, по-видимому, сохраняется и при А405>2 ед., где уже оптическую плотность нельзя надежно измерить. Для расширения концентрационного диапазона (в рамках сохранения линейности) можно попытаться измерять оптическую плотность при длине волны, соответствующей меньшей экстинкции (Saunders et al., 1984). Максимум поглощения для л-нитрофенола соответствует Х=405 нм. При Я,=450 нм экстинкция л-нитро-фенола составляет примерно одну пятую экстинкции в максимуме. Это означает, что, проводя измерения при двух длинах волн — 405 и 450 нм, можно в пять раз поднять допустимый верхний предел концентрации тестируемого компонента. При работе с обычным спектрофотометром это связано с необходимостью постоянного переключения длины волны с 405 на 450 нм для каждого образца. В то же время на фотометре со сменными фильтрами, рассчитанном на несколько длин волн и управляемом микропроцессором, можно делать то же самое в автоматическом режиме. Сравнивая значения поглощения, полученные при двух длинах волн, процессор может выбирать одно из них, более подходящее для расчета концентрации образца. По-стройшая таким образом система обеспечивает высокую чувствительность благодаря измерениям в максимуме и в то же время позволяет одновременно расширить концентрационный диапазон за счет дополнительных измерений при длине волны, соответствующей меньшей экстинкции. Существенно помнить, что чувствительность ферментативного иммунометрического анализа практически полностью определяется удельной ферментативной активностью конъюгата [фермент — антитело]. В связи с этим любое повышение удельной активности конъюгата, не сопровождающееся усилением его неспецифического связывания, будет приводить к повышению чувствительности, т. е. к снижению минимального значения концентрации тестируемого компонента, поддающегося определению данным методом анализа. [c.392]

Наибольшее распространение получили методы введения ферментной метки, основанные на образовании ковалентной связи между молекулами антитела и фермента. Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов окислением углеводного компонента фермента перйодатом натрия. В случае использования щелочной фосфатазы в качестве фермента-маркера применяют глутаровый альдегид, взаимодействующий с е-аминогруп-пами белковых молекул. [c.317]

Д. Добавление конъюгата антитело к дигоксигенину — щелочная фосфатаза отмывание добавление субстрата [c.197]

Чтобы определить, произошло ли лигирование, 5 -конец зонда X метят биотином, а З -конец зонда V — дигоксигенином, низкомолекулярным соединением, связывающимся с соответствующим антителом. После гибридизации и лигирования проводят денатурацию ДНК для высвобождения гибридизовавшегося зонда и переносят смесь в небольшую пластиковую лунку, покрытую стрептавидином. Лунку промывают, чтобы удалить весь материал, кроме связавшегося со стрептавидином биотинилированного зонда. Затем добавляют в лунку антитела к дигоксигенину, предварительно соединенные со щелочной фосфатазой. После промывания, в ходе которого происходит удаление несвязанного конъюгата, добавляют бесцветный хромогенный субстрат. Окрашивание раствора в лунке свидетельствует о связывании антитела к дигоксигенину с зондом, меченным дигоксигенином, т. е. о том, что этот зонд был лигирован с зондом, меченным биотином. Если же окрашивания не происходит, значит лигирования не было. [c.198]

Существует ряд методов, позволяющих ковалентно связать фермент с олигону-клеотидным зондом. В качестве примера 1 ожно рассмотреть пол гчение конъюгата олигонуклеотида-зонда с щелочной фосфатазой из кишечника теленка, уже упоминавшейся при описании иммуноферментного анализа. Из олигонуклеотида нетрудно получить производное [c.261]

Иммуноанализ проводят следующим образом. Полистирольные пробирки (80X11 мм) покрываются антителами при обработке 1 мл раствора антител. Растворы антител разбавляют ОД М N a-карбонатного буфера (pH 9,8) или фосфатным (солевым) буфером. Пробирки с этими растворами оставляют на 3 ч при 37 °С для хранения раствор оставляют в пробирках на холоду. Перед определением необходимое число пробирок промывают 0,9%-ным хлоридом натрия, содержащим 0,05% твина 20. В каждую пробирку помещают 0,5 мл одного из следующих растворов 1) стандартный раствор иммуноглобулина G, 2) неизвестный образец, 3) буферный раствор. После этого добавляют 0,1 мл разбавленного конъюгата щелочной фосфатазы и иммуноглобулина G (приготовленного с помощью сщивапия глутаровым альдегидом). Для разбавления используют фосфатный (солевой) буферный раствор, содержащий 1% сывороточного альбумина человека и 0,02% азида натрия. Пробирки инкубируют при комнатной температуре в течение ночи (16 ч) на роторной мешалке так, чтобы поверхность, покрытая антителами, покрывалась 0,6 мл раствора, находящегося в каждой пробирке. Затем пробирки промывают три раза раствором Na l-твин. Количество фермента, присоединенного к иммуноглобулину G, связанному стенками пробирок, покрытых антителами, определяют, добавляя 1 мл 0,05 М Na-карбонатного буфера (pH 9,8), содержащего 1 мг/мл п-нитрофенилфосфата и 1 ммоль/л хлорида. магния. Через 30 мин реакцию останавливают, добавляя 0,1 мл 1 М ХаОН. Измеряют оптическую плотность при 400 нм и строят стандартный график зави-си.мости ферментативной активности (изменение оптической плотности в единицу времени) индивидуальных образцов от содержания в них иммуноглобулина G. [c.382]

Добавьте второе антитело — конъюгаты козьих антикроличьих IgG со щелочной фосфатазой, разбавленные до концентрации 1 мкг/мл (обычно [c.152]

Щелочная фосфатаза и ее конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако недостатком является относительно высокая стоимость фермента. В последнее время разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы NADP. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт NAD определяется в ферментативной системе регенерации кофактора. Такого рода подходы для определения щелочной фосфатазы являются весьма перспективными в плане создания на их основе сверхчувствительных методов ИФА. -D-Галактозидаза является также широко используемым ферментом как в гомогенном, так и в гетерогенном ИФА, [c.64]

Синтез конъюгата тиротропина с щелочной фосфатазой. [c.184]

К 5 мг щелочной фосфатазы добавляют 0,85 мл раствора IgG (2 мг/мл) в 0,01 М фосфатном буфере, содержащем 0,15 М Na l, pH 7,4, п диализуют в течение ночи при 4 °С против того Же бу< ра для удаления солей аммония. Разбавляют раствор буфером до 1 мл и добавляют 10 мкл 25%-кого раствора глутарового альдегида. Перемешивают реакционную смесь 2 ч при комнатной температуре и диализуют в течение ночи при 4°С против того же буфера и затем против 0,01 М трис-буфера, pH 8,0. Полученный раствор конъюгата разбавляют до 4 мл трис-буфером, добавляют БСА до 1% и NaNa до 0,02%, фильтруют на фильтре с диаметром пор 0,2 мкм и хранят при 4°С. [c.184]

Известно несколько примеров получения конъюгатов IgG с пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, глюкозооксидазой и р-/)-галактозидазой с применением в качестве гомобифункциональ-ного сшивающего реагента п-бензохинона. Метод основан на реакции п-бензохинона с амино- и тиогруппами белка, скорость которой зависит от pH. Благодаря этому был разработан двухстадийный способ получения конъюгатов, когда п-бензохиноновое производное белка получают при pH б, выделяют, а затем смешивают с другим белком при pH 8. Одна из возможных схем реакции следующая [c.185]

Синтез конъюгата антител с щелочной фосфатазой через авидин-биотиновый комплекс. [c.192]

Литчфилд и др. (Lit hfield et al., 1981) разработали чувствительный и быстрый метод определения дигоксина с использованием заключенной в липосомы щелочной фосфатазы и конъюгата уабаин — мелиттин. Уабаин представляет собой аналог дигоксина, а мелиттин — 26-членный литический пептид из пчелиного яда. [c.22]

Указанных недостатков лишен иммуноанализ на основе цитолизина (рис. 9-4), в котором используют липосомы с одной полостью, образующиеся при удалении детергента диализом. Новый метод не требует ни присоединения лекарственного препарата к липосомам, ни использования комплемента и обеспечивает быстрый лизис везикул. Липосомы, применяемые для анализа по этому методу, при хранении в замороженном виде в атмосфере аргона устойчивы в течение одного года (т. е. непроницаемы для заключенной в них щелочной фосфатазы), нО теряют устойчивость при удалении из их состава холестерола. Как показала электронная микроскопия с негативным окрашиванием, средний размер везикул составляет примерно 0,2 мкм. Добавление к везикулам конъюгата [уабаин—мелиттин (20 нмоль/л) сразу же вызывает полный лизис, но лизиса не происходит в случае предварительной инкубации конъюгата с избытком антител против дигоксина (рис, 9-5). Проводя такую инкубацию в присутствии известных количеств дигоксина, можно построить калибровочную кривую (рис, 9-6). [c.127]

Важнейшим фактором, оказывающим непосредственное влияние на чувствительность анализа, является удельная активность ферментного конъюгата. Определив удельную активность в единицах количества субстрата, расщепляемого в единицу времени одним молем фермента в составе конъюгата, связанного с твердой фазой, можно сделать интересные расчеты. При проведении иммуноферментного анализа удобно работать в режиме, позволяющем получать приращение оптической плотности около 0,1 за 10 мин при конечном объеме реакционной смеси 1 мл. Это соответствует скорости изменения поглощения в диапазоне 0,01 опт. ед. в минуту. Для такого фермента, как щелочная фосфатаза, тестируемого по расщеплению п-нитрофе-нилфосфата, сформулированное требование соответствует при- [c.185]

Рис. 14-1. Сопоставление последовательности реакций в методе a-ELISA и в других антиген-специфических вариантах ELISA. ЩФ — щелочная фосфатаза темный шестиугольник— иммобилизованный антиген светлые Y-образные молекулы — первые антитела темные Y-образные молекулы — изотип-специфи-ческие антиглобулины Y-образные молекулы, помеченные точками — третьи антитела, в одном из вариантов конъюгированные с фосфатазой заштрихованные Y-образные молекулы — антитела против ЩФ. В двух вариантах (в середине схемы) используются обычные конъюгаты, полученные в одну стадию с помощью глутарового альдегида.

Смотреть страницы где упоминается термин Конъюгат фосфатазой щелочной: [c.69] [c.106] [c.58] [c.340] [c.348] [c.67] [c.68] [c.340] [c.348] [c.261] [c.253] [c.149] [c.192] [c.65] [c.94] [c.95] [c.105] [c.116] [c.119] [c.124] [c.186] [c.228] [c.248] [c.304] [c.305]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология