Иммуноглобулины козьи

В принципе возможен систематический анализ любой системы иммуноглобулин — лиганд. Исследование моделей связывания может проводиться систематическим образом, поскольку у млекопитающих, например кроликов или коз, синтез антител может индуцироваться по отношению к любой специально подобранной молекуле (с низкой или высокой молекулярной массой). Используя аффинную хроматографию, получаемые антитела затем очищаются. Как правило, эта процедура приводит к вырожденному иммунному ответу, т. е. к синтезу нескольких видов антител несколькими клонами так называемых клеток плазмы (542]. Эти антитела отличаются константами сродства к лиганду, что проявляется также в химических, спектральных и иммунологических свойствах центров связывания. Последующие анализы аминокислотной последовательности показали, что различия вызваны аминокислотными заменами в гипер-вариабельных областях доменов /ь и Ун [622]. На первый взгляд кажется, что вырожденный ответ должен усложнить пространственную организацию центров связывания. В действительности, однако, в этом случае возможно объединить и взаимно контролировать данные по нескольким центрам связывания, что заметно увеличивает вероятность нахождения правильных моделей. [c.245]

Метод является усложненным вариантом обычного двухцентрового или сэндвич -анализа, в котором образование комплекса детектируется не непосредственно введением в него меченного ферментом антитела, а с помощью содержащих ферментативную метку антивидовых антител. В качестве антивидовых (или вторичных) используют антитела, специфичные к глобулинам тех видов животных или птиц, которых иммунизировали антигеном для получения антисыворотки. Примером наиболее распространенных антивидовых конъюгатов являются меченные ферментом антитела кролика против иммуноглобулинов человека, меченые антитела козы (осла, барана и т. д.) против иммуноглобулинов кролика и т. д. [c.89]

Полоски инкубируют с конъюгатом (меченные пероксидазой IgG из сыворотки козы против иммуноглобулинов человека), разведенным в 1000 раз, 3 ч при комнатной температуре. [c.153]

Для определения относительного количества фермента, связавшегося с ХМТ, конъюгат смешивают с избытком антител кролика против ХМТ. Затем добавляют в избытке антитела козы против иммуноглобулинов кролика. После отмывки от избытка несвязанного конъюгата определяют ферментативную активность в осадке. Она должна составлять около 80% исходной активности фермента. В контроле с нормальной сывороткой кролика вместо антител против ХМТ ферментативная активность в осадке не обнаруживается. [c.259]

Желательно предварительно истощить антитело второго порядка экстрактом ли-зированных клеток Е. соН табл. 6.2). Антитела второго порядка должны быть специфичными по отношению к животному, служившему хозяином при получении антител, ис-иользовавшихся при скрининге, например кроличий антимышиный иммуноглобулин, связанный с пероксидазой хрена (DAKO) или антикроличьи иммуноглобулины козы, и т. д. [c.188]

Рис. 21-3. Зависимость преципитация лактатдегидрогеназы (ЛДГ-5) от количества добавленной антисыворотки. Различные аликвоты козьей антисыворотки против ЛДГ-5 (разведение 1 20) инкубировали с препаратом очищенной ЛДГ-5 человека в течение 5 мин. После добавления иммобилизованных на нерастворимом носителе ослиных антител против иммуноглобулинов козы и отделения образующихся нммунокомплексов с помощью центрифугирования в супернатантах определяли остаточную активность фермента.

Сначала гель инкубировали в течение ночи при 37 с разбавленной (1 10) тем же буфером антисывороткой козы против сопоставляемого вирусного гликопротеида. Затем не связавшуюся антисыворотку и все прочие белки молока растворяли и вымывали из геля с помощью СФБ в течение 3 сут. После этого гель инкубировали в течение 1,5 ч при 37° в растворе продажной антисыворотки кролика против иммуноглобулинов козы. Снова отмывали его от несвязавшейся сыворотки и белковые зоны окрашивали как обычно [Dion et al., 1980]. [c.128]

Как и при иммуногистологических методах можно обходиться без мечения специфичных к белку антител, обычно вырабатываемых в организме кролика, используя вместо этого имеющиеся в продаже меченые специфические антитела против иммуноглобулинов кролика. Однако это усложняет процедуру исследования. Для описанного варианта метода необходимо, чтобы сорбированные антитела, специфичные к белку, индуцировались У иного животного, чем кролик, — это означает дополнительную выработку антител против белка, например, у козы (этап /). [c.107]

Желательно провести предварительную адсорбцию антител второго порядка экстрактом лизированных клеток Е. соН (табл. 6.2). Антитела второго порядка должны обладать специфичностью по отношению к животному, из крови которого выделяли антитела первого порядка, использовавшиеся при скрининге, например антимышиные иммуноглобулины кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (DAKO), козьи антитела к иммуноглобулинам кролика и т. д. [c.174]

Чужеродность. Чтобы молекула выступила в качестве иммуногена, она должна быть распознана иммунной системой как не своя . Это качество антигена кажется очевидным. При этом не все чужеродные молекулы способны вызвать иммунный ответ равной силы. Хорошо известно, что филогенетическая уцаленность донора антигена от реципиента и выраженность иммунного ответа находятся в прямой зависимости. Например, синтез антител к бычьему сывороточному альбумину легче вызвать у 1фолика, чем у козы. Кролики относятся к отряду зайцеобразных, а козы и быки включены в другой отряд — парнокопытных. В зависимости от особенностей антигена его иммуногенные свойства будут проявляться и на внутривидовом (индивидуальном) уровне. Получение антител к антигенам гистосовместимости или аллотипам иммуноглобулинов — обычный прием исследовательской работы. В то же время антитела к альбумину при внутривидовой иммунизации не образуются. В графической форме эти отношения представлены на рисунке 1.2. [c.36]

Изотипические детерминанты. Для выявления этих детерминант получают антитела, иммунизируя соответствующими иммуноглобулинами данного вит,а особей другого биологического вида. Тем самым выявляются различия в строении соответствующих иммуноглобулинов донора и реципиента. Из этого вытекает, что чем более удалены друг от друга на эволюционной лестнице донор и реципиент, тем большее число изотипических детерминант удастся выявить в иммуноглобулине донора. Так, для наиболее полного анализа изотипа иммуноглобулинов млекопитающих следует получать антитела против них, иммунизируя птиц. На практике однако чаще используют анти-изотипические сыворотки млекопитающих. При этом для анализа того или иного иммуноглобулина целесообразно использовать антисыворотки от различных в видовом отношении реципиентов. Видовые различия в ответе на изотипическне детерминанты отчетливо видны из следующего примера при иммунизации козы IgG кролика образуются почти исключительно антитела против детерминант F -участка молекулы при иммунизации тем же белком осла образуется примерно равное количество антител против Fab- и F -участков молекулы. [c.76]

Существует определенная схема выявления специфического связывания антител с антигеном. Клетки-мишени могут быть живыми, зафиксированными глутаровым альдегидом, высушенными на стекле или же присутствовать в замороженных гистологических срезах. Тест неизбежно является непрямым, и реагентом для второй стадии могут служить антимышиные иммуноглобулины овцы, козы или кролика, меченные флуоресцеином, ферментом или радиоактивным иодом. Обычно пробу (одну каплю) супернатанта добавляют к 0,5-10 клеток-мише-ней в небольшом объеме в маленькой пластиковой пробирке или в лунке панели. После 30—60 мин инкубации при 4°С суспензию разбавляют, клетки осаждают центрифугированием, отмывают один раз и инкубируют в течение 30 мин при 4°С с соответствующими разведениями поливалентного антимышино-го иммуноглобулина, конъюгированного с флуоресцеином. Клетки вновь отмывают и регистрируют флуоресценцию непосредственно под флуоресцентным микроскопом или с помощью проточного цитофлуориметра системы FA S [14]. Более детально упоминаемые процедуры скрининга изложены в кн. 2. [c.136]

Клетки инкубируют 30 мин во льду с ФИТЦ-антимыши-ными иммуноглобулинами. ФИТЦ-конъюгированные Р(аЬ )г-фрагменты козьих антител против иммуноглобулинов мыши [c.464]

Козьи антитела (lg) к иммуноглобулинам человека, конъюгированные с ФИТЦ (Behringwerke AG, Марбург/Лан, ФРГ), [c.211]

При одинаковой специфичности и степени флуорохромирования реагенты, приготовленные из кроличьих и козьих антисывороток, могут сильно различаться по окрашивающим свойствам. Дело в том, что иммуноглобулины кролика теряют свою активность при молярном соотношении больше 2 или 3, в то время как бараньи или козьи антитела сохраняют способность к окрашиванию даже после интенсивного флуорохромирования (до 5—7 молекул флуоресцеина иа молекулу IgG). [c.172]

Наиболее часто применяемый кроличий иммуноглобулин флуорохромируется слабее бараньего или козьего. В зависимости от свойств флуорохромов эти видовые особенности могут быть выгодны или невыгодны. Например, при работе с флуоресцеином хорошее окрашивание дают сильно флуорохромированные реагенты (2—5 ФИТЦ-групп на молекулу IgG), такими могут быть, иммуноглобулины барана или козы, но не кролика. В случае ТРИТЦ, напротив, успешное окрашивание достигается при ела- [c.178]

Весьма часто приходится сталкиваться с таким типом замыкания , при котором первичные антитела узнают носитель в составе комплекса [гаптен — носитель] (тип А). Нам удается преодолеть эту проблему благодаря использованию альбумина, выделенного из организма — донора первичных антител, в качестве носителя для гаптена. При этом ни в одном из препаратов мы ни разу не обнаружили присутствия антител к гомологичному альбумину. Для решения проблем, связанных с замыканием типа [антиген — изотип-специфический антиглобулин] (тип Б) или [антиген — мостиковые антитела] (тип В), необходимо проводить адсорбционную очистку антиглобулинов. Часто приходится сталкиваться с побочным узнаванием человеческого IgG мостиковыми козьими антителами против кроличьих иммуноглобулинов. Для предотвращения взаимодействий такого типа необходимо провести аффинную очистку мостиковых антител на колонке с иммобилизованным человеческим IgG. [c.216]

Методика иммуноферментного анализа. Смешивают в стеклянных пробирках (16X100 мм) по 20 мкл стандартных растворов или образцов плазмы с 30 мкл буфера А. Осторожно перемешав, прогревают растворы в кипящей водяной бане 10 мин. После охлаждения добавляют 0,4 мл буфера Б и 0,1 мл раствора конъюгата. Растворы перемешивают и добавляют 0,1 мл антисыворотки против кортизола в разведении 1 500 (конечное разведение 1 3000) и инкубируют при комнатной температуре в течение 60 мин. После добавления 100 мкл нормальной сыворотки кролика, разведенной в 40 раз, приливают 100 мкл раствора козьих антител против иммуноглобулинов кролика. Смесь перемешивают на вортексе, инкубируют 2 ч при 4°С, затем центрифугируют 10 мин при 2000 g. Осадок дважды промывают буфером Б, Активность фермента в осадке определяют с использованием в качестве субстрата о-нитрофенил-p-D-галактоз и да. Время инкубации при измерении ферментативной активности 1 ч. Количество образовавшегося к концу реакции о-нитрофенола определяют спектрофотометрически при 420 нм. [c.268]

Ферритин выделяли по модифицированной методике Гранина (Grani k, 1942) и подвергали дополнительной очистке на сефарозе 6В. Каждому кролику вводили по 100 мкг очищенного ферритина, смешанного с равным объемом адъюванта Фрейнда. Через И нед проводили повторную иммунизацию такой же дозой антигена. Спустя еще 8 нед от 5 кроликов брали кровь, из которой получали антисыворотку, используемую для покрытия фильтров антителами. Антитела козы против иммуноглобулинов кролика приобретали у Antibodies, [c.303]

ГО комплекса [первичные антитела — вторые антитела]. Пример подбора оптимальной концентрации антител для покрытия фильтров и последующего определения ферритина показан на рис. 20-4. Растворы с тремя различными концентрациями первичных кроличьих антител к ферритину смешивали с различными разведениями препарата козьей антисыворотки, специфичной к иммуноглобулинам кролика, в указанных соотношениях. Образование иммунокомплекса протекало в течение 24 ч. После отделения нерастворимых компонентов смеси фильтрованием через мембранный фильтрат, содержащий растворимый комплекс, наносили на фильтры и высушивали. Готовые фильтры хранили в сухом виде при 2—S . В этих условиях они были устойчивы по крайей мере в течение года. Аналогичный процесс оптимизации осуществляли с антителами к дигоксину и тироксину. [c.304]

Инкубируют с биотинилированными антителами козы против иммуноглобулинов кролика в разведении 1 200 в течение 30 мин. [c.419]

Ферментную фракцию с добавленной в нее антисывороткой кролика инкубировали 3—5 ч на холоду. За это время реакция образования первичных иммунных комплексов проходила до конца. Преципитата, как уже упоминалось, не образуется из-за ничтожности концентрации антигена (ПНФ) и неэквивалентности концентраций антигена и первичных антител. Затем к смеси добавляли 3,5 мкл продажного препарата антисыворотки козы против иммуноглобулинов кролика и инкубировали еще 3—5 ч на холоду. Теперь уже формировалась сетка иммунопреципитата, где в качестве антигенов выступали иммуноглобулины кролика, связанные или не связанные в иммунные комплексы с ПНФ. [c.271]

Одновременную инкубацию обоих конкурентов (меченого и немеченного миозина) с первичными антителами использовали Кларк и соавторы для отбора моноклональных гибридбм — продуцентов антител против миозина. Роль иммунной сыворотки в этих опытах каждый раз играли среды культивирования различных гибридом, полученных в результате слияния клеток селезенки крыс и мышей, иммунизированных миозином, и клеток миеломной линии P3-X63-Ag8. Инкубацию проводили в боратном буфере (pH 8,4), содержащем 40 мМ пирофосфата натрия, по 1% Тритона Х-100 и дезоксихолата, а также 2% нормальной сыворотки крысы или мыши. Эту сыворотку вводили опять-таки ради создания эквивалентного соотношения концентраций при последующем добавлении вторичных антител в составе анти сыворотки козы против иммуноглобулинов крысы или мыши Использовав для конкуренции миозин гомологичного и гетеро логичного происхождения, авторы выясняли степень специфич ности антител, синтезируемых гибридомами [ lark et al., 1980] [c.282]

Рис. 20.2. А. Вирусные антигены в клетках СУ-1 через 48 ч после заражения реови усом типа 3. Клетки окрашивали кроличьей сывороткой против реовя-руса, а затем козьими антителами к иммуноглобулинам кролика, конъюгированными с флуоресцеином. Цитоплазматические включения имеют вид мшго-численных округлых белых пятен. Размер включений тем больше, чем ближе они расположены к ядру. Масшта б — 20 мкм. Б. Электронная микрофотография области клетки СУ-1, зараженной реовирусом типа 3, которая содержит вирусные включения. Увеличение 5250. (Из работы [257] с разрешения авторов.)

Смотреть страницы где упоминается термин Иммуноглобулины козьи: [c.179] [c.270] [c.274] [c.106] [c.383] [c.208] [c.211] [c.358] [c.273] [c.420] [c.428] [c.496] [c.178] [c.206] [c.222] [c.212] [c.266] [c.266] [c.319] [c.84] [c.117] [c.273] [c.119] [c.58] [c.121]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология