Дыхательная цепь методы определения

В 60-х гг. XX в., благодаря методам мягкого разрушения интактных митохондрий, бьши выделены четыре дыхательных комплекса (I, П, П1, IV), каждый из которых способен катализировать определенную часть полной последовательности реакций дыхательной цепи [c.199]

У всех известных переносчиков водорода дыхательной цепи спектральные свойства претерпевают характерные изменения при окислении и восстановлении. Это позволяет следить за переносом водорода в дыхательной цепи с помощью спектроскопических методов. Спектроскопическое определение специфических соединений в биологических системах осложнено относительно большими неспецифичными изменениями в фоновом поглощении. Это затруднение преодолевают, применяя спектрофотометры двух типов. [c.221]

Второй метод основан на определении точек пересечения, образующихся при восстановлении дыхательной цепи в присутствии ингибитора. Метод определения такой точки лучше всего [c.227]

КОМПОНЕНТЫ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДРИЙ И МЕТОДЫ ИХ ОПРЕДЕЛЕНИЯ [c.100]

Метод Варбурга, применяемый для исследования окислительных процессов в тканях и окислительного фосфорилирования, не пригоден для массового обследования животных, так как он трудоемок, требует затраты большого количества времени. В настоящее время все более широкое распространение получают методы полярографического исследования определение кислорода в гомогенатах и срезах тканей, изучение переноса электронов и энергии в дыхательные цепи, а также исследование напряжения кислорода в тканях методом вживления электродов (И. М. Эпштейн, 1960 М. Н. Кондрашова, 1965 Н. В. Саноцкая, 1961). [c.230]

Принцип этого метода в основном тот же, что и принцип метода, примененного Сенгером для определения последовательности аминокислот в молекуле инсулина. Вначале дыхательную цепь разделяют на фрагменты или механически (методом ультразвука), или путем разрушения липидного цемента детергентами, спиртами или дезоксихолевой кислотой. Затем фрагменты разделяют с помощью ультрацентрифугирования. Определяя химические и ферментные свойства этих фрагментов, можно реконструировать последовательность реакций интактной дыхательной цепи. Этот метод был впервые чрезвычайно успешно применен Грином и его сотрудниками. В целях удобства работу проводили почти исключительно на митохондриях животных. Дыхательная цепь особенно легко поддается расщеплению в некоторых точках, указанных на фиг. 62 буквами. При расщеплении в точке А из дыхательной цепи высвобождаются пиридинпротеиды, образуя фрагмент ( переносящую электрон частицу ), уже не способный окислять промежуточные продукты цикла Кребса, но получивший теперь способность окислять НАД-На (в отличие от интактных митохондрий). Таким образом, при расщеплении в точке А удаляются пиридин-протеиды, необходимые для дегидрирования кислот цикла Кребса, но в то же время открываются участки, пригодные для окисления НАД-Нг. Многочисленные исследования были проведены с так называемой переносящей электрон частицей . Расщепление в точках В Л О приводит к образованию фрагмента, обладающего сукци-нат-цитохром-с-редуктазной активностью, но не активного по отношению к связанным с пиридиннуклеотидами субстратам. Обычно наблюдается хорошее соответствие между ферментативной актив- [c.225]

Первый метод основан на определении вре.меннбй последовательности, в которой реагируют компоненты этой цепи. Можно определить последовательность реакций восстановления в преимущественно окисленной дыхательной цепи или, наоборот, последовательность реакций окисления в преимущественно восстановленной цепи. Для митохондрий животных Чанс и Уильямс [9] приводят следующую последовательность реакций восстановления вначале восстанавливаются пиридиннуклеотиды, далее флавопротеиды, затем цитохромы Ь, Сь с, а и а - Реакции окисления преимущественно восстановленной цепи осуществляются в противоположной последовательности. Так, цитохром Оз окисляется первым, а затем окисляются цитохромы а, с, Сь Ь, флавопротеиды и, наконец, пиридиннуклеотиды. [c.226]

Поэтому потребовалось разработать третий подход, а именно установление последовательности реакций в дыхательной цепи путем точного определения временной последовательности реакций с окислителями и восстановителями. Этот метод был применен для оценки роли цитохрома Ъ в дыхательной цепи млекопитаю-ш их [12] и для определения порядка реакции цитохромов, флавопротеидов и восстановленного пиридиннуклеотида в изолированных митохондриях и интактных клетках [20, 22]. [c.68]

Рис. 4.9. Определение соотношения Н+/0 в митохондриях методом кислородных пульсов. Использован тот же прибор, что и дли определения Д)хн4. (рис. 4.3), но без К+-электрода. Концентрированную суспензию митохондрий инкубируют в анаэробных условиях в среде с низкой буферной емкостью, содержащей субстрат, валиномицин и КС1 в высокой концентрации. рН-Элект-род должен иметь малое время ответа. Реакцию начинают быстрым добавлением небольшого количества среды, насыщенной воздухом (содержит около 5 нмолей 0-мг белка- ). Наблюдается быстрое закисление среды в результате работы дыхательной цепи, которая за 2—3 с использует добавленный Ог. Валиномицин и К необходимы для того, чтобы предотвратить образование Аг ), который препятствует дальнейшему выбросу протонов. По исчерпании Ог pH среды восстанавливается, так как протоны возвращаются в матрикс. Этот процесс может определяться (I)—протонной проводимостью мембраны (добавление F P ускоряет процесс) (П)—эндогенным Ма+/Н+-апти-портом (П1) —электронейтральным входом Pi (разд. 7.5). Для расчета Н+/0 кривую следует экстраполировать к моменту, когда Ог еще не исчер-лан. В — валиномицин.

Недавнее возрождение интереса к микробным топливным элементам и сенсорам связано с открытием, что при помощи сопрягающих редокс-реакций можно установить прямую и эффективную связь между процессами на электроде и дыханием микробов. В таком прямом микробном топливном элементе источником энергии является хорошо изученная способность микроорганизмов восстанавливать редокс -активные вещества, образующиеся на начальных или промежуточных стадиях катаболизма. При этом электроны из богатых ими внутриклеточных веществ могут выводиться из нормальных дыхательных цепей посредством соответствующих сопрягающих реакций и через анод попадать во внешнюю цепь [8, 9]. С некоторыми конструктивными изменениями топливный элемент можно приспособить для использования в качестве сенсора, поскольку поток электронов, возникающий при электрохимическом окислении, легко измерить амперометрически или другими методами, а в определенных [c.238]

Один из методов, получивших чрезвычайно широк распространение в биологии, основан на полярографич ском измерении концентраций кислорода в тканях и жи костях, дающем возможность судить о снабжении органа и тканей кислородом либо о скорости его потребления. П лярографическое определение скоростей потребления ки лорода в различных стационарных состояниях, позволя) щ е оценить состояние дыхательной цепи, а также пун тов, в которых произошли нарушения, проводится как i классическом для биохимиков объекте — изолированш ийтохондриях, так и на сложноорганизованных сист мах — клетке, тканях. [c.6]

Для определения реакций ПОЛ использовали ферментативную и неферментативную системы перекисного окисления (Константинов и др., 1989). Определение диеновых коньюгатов (продуктов ПОЛ) проводили по модифицированному методу Стальной (Стальная, 1977). При изучении влияния функционировании различных комплексов дыхательной цепи на ПОЛ в митохондриях использовали те же субстраты цикла трикарбоновых кислот, что и при изучении их функциональной активности. [c.11]