Методы выделения митохондрий

Одним из основных параметров, характеризующих обмен выделенных митохондрий, является их способность к поглощению кислорода и зависимость скорости дыхания от присутствия акцепторной системы (АДФ-ЬФн) (см. также с. 462). В связи с этим для изучения метаболизма митохондрий необходимо иметь метод, позволяющий точно измерить поглощение кислорода при окислении митохондриями тех или иных субстратов. [c.480]

Методы выделения митохондрий пластинок не были разработаны, и вопрос о содержании их в этих форменных элементах был недостаточно ясен. В связи с этим нами были подобраны условия для изолирования митохондрий (точнее, гранулярной фракции), которые заключались в следующем. [c.137]

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ МИТОХОНДРИЙ [c.154]

Выделенные этим методом растительные митохондрии соответствуют изложенным критериям и служат превосходным материалом для экспериментальных исследований. Было показано, что этот метод применим для работы с самыми разнообразными растительными тканями (Боннер мл. и Сайкс, неопубликованные данные. [c.58]

ДИ, которые работали только с крысами, разработала метод получения митохондрий, т. е. содержащих ферменты телец, из тканей скота, забиваемого на бойне. После выделения ферментов из митохондрий висконсинская группа испытала каждый из них и обнаружила, как и следовало ожидать, что для каждой из четырех последовательных стадий окисления жирных кислот имеется свой фермент. Итак, были установлены четыре фермента и четыре продукта реакции. [c.191]

В опытах с листьями наземных растений в замкнутой системе (фиг. 38, Б) имеются еще более сложные источники ошибок. Здесь один и тот же воздух в течение продолжительного времени циркулирует, проходя последовательно через прибор для измерения концентрации и через листовую камеру. Поэтому фотосинтез происходит при непрерывно уменьшающейся концентрации СОа и скорость его в любой момент времени можно определить, исходя из известного объема системы и наклона кривой, описывающей изменение концентрации СО2 во времени. Этот наклон определяется не только скоростью поглощения и выделения СО2 (соответственно хлоропластами и митохондриями), но и наружной концентрацией СО2 в данный момент времени, предшествующими изменениями этой концентрации во времени и, наконец, всеми значениями внутреннего сопротивления движению СО2. При наличии,очень точного метода определения концентрации объем замкнутой системы можно сделать достаточно большим относительно поверхности листа для того, чтобы снижение концентрации происходило крайне медленно (и вместе с тем поддавалось измерению). В противном случае видимый фотосинтез следует измерять в открытой или, еще лучше, в полузамкнутой системе (см. ниже), так как в этих случаях можно поддерживать постоянную скорость фотосинтеза, пополняя запас СО2 в воздухе по мере его расходования. Следует указать, что те же самые рассуждения приложимы и к опытам с открытой и замкнутой системами, в которых измеряются изменения концентрации кислорода, поскольку выделение кислорода обычно считается эквивалентным поглощению СОг- Однако теоретичесю [c.85]

Митохондрии занимают значительную часть цитоплазмы почти во всех эукариотических клетках. Хотя митохондрии настолько велики, что их можно увидеть в обычный световой микроскоп, и впервые были обнаружены еще в прошлом веке, все же реальная возможность разобраться в их функции появилась только после 1948 г., когда были разработаны методы выделения интактных митохондрий. По техническим причинам большинство биохимических исследований проводилось на митохондриях, выделенных из печени [c.431]

В этом варианте препарат в виде тонкого слоя помещают в пробирку поверх среды, плотность которой обычно меньше плотности выделяемых частиц, и затем подвергают центрифугированию. Под действием приложенной центробежной силы частицы движутся в виде отдельной полосы через градиент, который служит лишь для того, чтобы предотвратить размывание зоны, или полосы в результате конвекции. Этот исключительно полезный метод, очень широко применяемый как для аналитических, так и для препаративных целей, используется для выделения и характеристики частиц всех размеров, начиная от таких крупных объектов, как вирусы, ядра и митохондрии, и кончая рибосомами, а также чистыми белками и нуклеиновыми кислотами. [c.250]

Исследование обмена по циклу Кребса у грибов проводится теми же путями, что и при изучении процесса гликолиза. Оценка по анализу ферментативных систем цикла ТКК затрудняется тем, что большинство его ферментов, в противоположность ферментам путей гликолиза, находящимся в цитоплазме, локализуется в органоидах клетки — митохондриях, легко разрушающихся при их изоляции в бесклеточных экстрактах грибов. При работе с этими ферментами потребовалась разработка специальных мягких методов выделения митохондриальных фракций клеток и последующего отделения ферментов от структурных белков митохондрий, с которыми они связаны, без потери их активности. Для этого было применено быстрое механическое разрушение клеток в подходящем растворителе, заключение их в раствор сахарозы, препятствующий набуханию митохондрий, удаление вредных металлов и т. д. Дыхательные гранулы из митохондрий, активно дышащие и крася- [c.70]

До сих пор не существует стандартного метода выделения этой фракции из различных органов и тканей. Более того, даже прц получении микросом из одной и той же ткани всегда следует иметь в виду, с какой целью выделяется фракция. Например, если предполагают изучать редокс-цепи цитоплазматической сети, то основное внимание следует уделить возможным загрязнениям митохондриями. Если предполагают изучать биосинтез белка, то необходимо предпринять все меры предосторожности для того, чтобы не повредить полисомные комплексы и их связь с мембранами, [c.50]

Микротельца представляют собой образования, близкие по величине к митохондриям. С точки зрения методов выделения микротелец, важным является то, что их мембраны проницаемы для сахарозы (митохондрии для сахарозы непроницаемы) и ультрацентрифугирование в градиенте плотности этого вещества дает удовлетворительные результаты по идентификации органелл. Эти структуры овальной формы, образованы элементарной мембраной и тонкозернистым матриксом. Диаметр микротелец составляет 0,6—0,7 мкм. Число их в клетке (например, печени) достигает 100 и в 5 раз превышает количество лизосом. [c.19]

Выбор ткани для фракционирования определяется конкрет-ньши условиями эксперимента и объектом исследования. Ткани и клетки различных органов различаются по составу, хрупкости и плотности,- что в свою очередь определяет выбор того или иного метода выделения. Печень, например, является идеальным объектом для изучения функционирования митохондрий, поскольку именно 2 [c.35]

Выделение ДНК из митохондрий основано на тех же методах, которые используются для выделения ДНК из клеточного ядра в этом случае, однако, предварительно выделяют соответствующие субклеточные частицы и перед разрушением обрабатывают их ДНК-азой, что позволяет удалить возможную примесь ядерной ДНК. Исследование физических свойств митохондриальных ДНК, выделенных из разных источников, показывает, что во многих случаях этот вид ДНК отличается от ядерной ДНК по плавучей плотности и температуре плавления и, следовательно, имеет другой нуклеотидный состав. Митохондриальная ДНК имеет мол. вес " около 10-10 и существует в виде двухцепочечного комплекса, который обладает способностью легко ренатурировать. [c.35]

Методом ТСХ исследованы липиды печени здоровых мышей [227], надпочечных желез крыс [228], почек кроликов [229], мозга и печени крупного рогатого скота [230], мозга свиней [231], синаптического сосуда головного мозга крыс [232], надпочечных желез собак [233], белых мышц тунца [234], печени зародыша цыпленка [235] и эритроцитов крупного рогатого скота [236]. Из митохондрии печени крыс выделен фосфатидилглицерин [237]. [c.96]

Печень дважды промывают охлажденной средой вьщеления и помещают в чашку Петри, стоящую на льду. После измельчения ножницами кусочки печени снова дважды промывают охлажденной средой вьщеления. Кусочки печени в соотношении 1 9 к среде выделения с 0,02 М трис-буфером гомогенизируют в гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в течение 40 с. Вьщеление митохондрий осуществляют методом дифференциального центрифугирования [c.137]

Метод замораживания и хранения изолированных митохондрий. Митохондрии — четко выраженная мембранная структура с весьма тонкой архитектоникой, содержащая системы дыхания и окислительного фосфорилирования. Митохондрии нельзя хранить в изолированном состоянии при комнатной температуре, так как они быстро разрушаются. При температурах порядка О—4°С митохондрии в средах выделения можно сохранять не более 1—2 ч, так как они подвергаются ишемии и гибнут в результате быстрого развития процессов перекисного окисления липидов и денатурации ферментативных комплексов, регулирующих окислительное фосфорилирование. Замораживать митохондрии можно под защитой криопротекторов — диметилсульфоксида (ДМСО) или полиэтиленоксида (ПЭО). Для этого свежую печень крыс измельчают ножницами в холодной стандартной среде выделения и навеску заливают 9-кратным объемом этой среды. После измельчения в гомогенизаторе типа стекло — тефлон в течение 30—40 с гомогенат центрифугируют при 600 об/мин в течение 10 мин, надосадочную жидкость — при 6000 об/мин в течение 15 мин. Митохондрии, находящиеся в осадке, суспендируют в 2 мл сре- [c.74]

Скоростное центрифугирование. Для выделения и изучения частиц, входящих в состав цитоплазмы, применяют метод скоростного центрифугирования. Он основан на различной скорости осаждения частиц из раствора при сильном его вращении. Измельченные клетки в растворе сахарозы при температуре 0°С помещают в скоростные центрифуги, в которых достигается очень большая скорость вращения — до 40 тыс. и более оборотов в минуту. При небольших скоростях центрифугирования осаждаются, так самые тяжелые, клеточные ядра при увеличении скорости отделяются митохондрии — частицы, которые едва заметны в световом микроскопе при еще больших скоростях осаждаются частицы, невидимые в обычных микроскопах,— рибосомы и полисомы при самых больших скоростях выделяются содержащиеся в цитоплазме белки и остается однородная вязкая жидкость — гиалоплазма. [c.18]

В ряде работ отмечалось, что 2,4-Д и 2,4,5-Т энергично вмешиваются в фосфорный обмен растений, вследствие чего содержание неорганического фосфора повышается параллельно снижению содержания органических фосфорных соединений [2—4]. Неоднократно наблюдалось ослабление зависящего от АТФ ио-ступления ионов в растения, обработанные 2,4-Д [5, 6]. В 1952 г. Броди [7] на митохондриях из печени крысы показал, что 2,4-Д способна разобщать окисление пирувата и сопряженное с ним фосфорилирование. Впоследствии, когда были освоены методы выделения митохондрий из растительных тканей, разобщающая активность галопдфеноксикислот была продемонстрировапа п на этих объектах [8—11]. Более того, в опытах Веддинга и Блэка [12] под влиянием 2,4-Д у хлореллы наблюдалось заметное ослабление включения в АТФ. Недавно выяснено, что [c.170]

После гомогенизации ткани митохондрии легко отделяются от клеточных обломков, а также от других цитоплазматических включений при помощи дифференциального центрифугирования. Как показывает опыт работы с митохондриями животных, все операции по выделению нужно проводить так, чтобы изолированный материал удовлетворял определенным жестким требованиям [13, 19]. Эти требования следующие 1) высокая степень контроля дыхания со стороны АДФ 2) удовлетворительное отношение Р О, соответствующее общепринятым пределам этой величины для различных субстратов окисления 3) высокое отношение пиридинну-клеотидов к цитохромам 4) сходство ультраструктуры изолированных митохондрий со структурой митохондрий интактной клетки. Общая схема метода выделения растительных митохондрий, представляющего собой модификацию методики Вискича и Боннера [96], приведена на фиг. 23. [c.58]

Цитология ферментов — сравнительно новая область биологии, изучающая связь ферментов с различными комнонентами клетки. Данная книга представляет собой первое систематическое изложение основ этой науки. В ней детально рассмотрены ферменты всех компонентов клетки (ядра, митохондрий, хлоро-пластов, лизосом, мембрапных структур, рибосом и растворимой фазы), их локализация, свойства, методы выделения и исследования и т. д. Книга хорошо иллюстрирована, снабжена большой библиографией, указателями. [c.279]

Быстрое развитие теоретических работ в области физиологии и биохимии растений и разработка новых экспериментальных методов исследования органелл растительной клетки требуют постояршого совершенствования методической подготовки исследователей-биологов. Изучение биоэнергетики растений на современном уровне связано с применением сложных методов выделения и анализа митохондрий растений. В то же время выделение функционально активных митохондрий растений имеет ряд особенностей и связано с преодолением определершых методических трудностей. В связи с этим возникла необходимость сведения в одном издании рекомендаций, основанных на нашем опыте многолетней работы по изучению растительных митохондрий. [c.2]

Один из методов получения субмитохондриальных частиц (СМЧ) основан на обработке предварительно выделенных интактных митохондрий ультразвуком. Полученные таким способом СМЧ представляют собой замкнутые везикулы, образованные внутренней мембраной митохондрий. Формирование везикул под действием ультразвука происходит таким образом, что обращенная в матрикс интактных митохондрий поверхность внутренней мембраны становится наружной, обращенной в окружающую среду поверхностью мембраны СМЧ. Такое изменение ориентации мембраны делает СМЧ весьма удобным, а иногда и единственно пригодным объектом для изучения механизма реакций, протекание которых в интактных митохондриях опосредовано (и может контролироваться) трансмембранным переносом веществ. Препараты СМЧ широко используются, в частности, при изучении АТФ-синтетазного комплекса, активный центр которого в этом объекте экспонирован в окружающую среду и свободно доступен для субстратов и продуктов катализируемой им реакции. [c.408]

Выделение. Одии из первых этапов выделения Б,-получение соответствующих органелл (рибосом, митохондрий, ядер, цитоплазматич. мембраны) с помощью дифференциального центрифугирования. Далее Ь переводят в растворимое состояние путем экстракции буферными р-рами солей и детергентов, иногда-неполярными р-рителями. Затем применяют фракционное осаждение неорг. солями [обычно (N 14)2804], этанолом, ацетоном или путем изменения pH, ионной силы, т-ры. Для предотвращения денатурации работу проводят при пониж. т-ре (ок. 4°С) с целью исключения протеолиза используют ингибиторы протеаз, нек-рые Б. стабилизируют полиоламн, иапр. глицерином. Дальнейшую очистку проводят по схемам, специально разработанным для отдельных Б. илн группы гомологичных Б. Наиб, распространенные методы разделения-гель-про-никающая хроматография, ионообменная и адсорбц. хроматография эффективные методы-жидкостная хроматография высокого разрешения и аффинная хроматография. [c.250]

Ряд фактов свидетельствует о конформационных переходах в лиембранах. Структурные изменения обнаруживаются при помощи флуоресцентных и парамагнитных меток, при измерении. двойного лучепреломления и рассеяния света, методом кругового дихроизма. В мембранах наблюдаются фазовые переходы — плавление липидов. Такой переход происходит вблизи О°С при нагревании мембран митохондрий и микросом от —40 °С. С помощью спин-меток в суспензии плазматических мембран, выделенных из фибробластов мыши, найдены температуры латерального разделения фаз в липидах. Для внешнего монослоя липидов такие переходы наблюдаются при 15 и 31 °С, для внутреннего — при 21 и 37 °С. [c.338]

Для изучения набухания и сократительных свойств митохондрий использовали спектрофотометрический метод Клиленда ( leland, 1952). Метод основан на изменении светорассеивающих свойств суспензии при поглощении или выделении воды митохондриями. При поглощении воды органоидами оптическая плотность суспензии падает. Сокращение частиц, приводящее к выталкиванию воды, выражается в повышении оптической плотности раствора. Работу проводили на спектрофотометре СФ-4 при 520 ммк в 1-сантиметровых кюветах при ширине щели 0,025 мм. Осадок митохондрий из 4 г отрезков мезокотилей ресуспендировали в растворе 0,5 М сахарозы без ЭДТА из расчета [c.201]

В настоящее время этот метод является основным методом определения жирнокислотного состава отдельных классов липидов, выделенных из природных объектов. В ряде случаев используют сочетание методов тонкослойной хроматографии на силикагеле, пропитанном AgNOз, и газо-жидкостной хроматографии [13]. С помощью этого метода изучено распределение жирных кислот в отдельных органах и тканях животного организма, в отдельных элементах клетки (митохондрии, микросомы и т. д.) и других липидных системах. Он широко используется для изучения изменения жирнокислотного состава липидов при различных патологических состояниях организма. [c.197]

При экстрагировании цельной ткани белки могут быть отделены от каждого из структурных элементов, входящих в состав клетки. Предварительное отделение структурных элементов облегчает выделение и идентификацию каждого из компонентов. Описан ряд методов, пригодных для отделения в относительно неизмененном состоянии ядер и митохондрий от других составных частей клетки. Шнейдер и Хогебум [52] опубликовали недавно обзор методов, применяемых в этой области, и достигнутых при их помощи результатов. До сих пор количество выделенных фракций клеток, естественно, было мало. Перри [53] получил неизмененные миофибрилы, обрабатывая срезы мышц коллагеназой. Оболочки клеток бактерий [40] и тени [2] эритроцитов были разделены после разрушения клеток. [c.14]

Предварительная обработка тканей или их составных частей приводит к удалению или разрушению посторонних мешающих компонентов, что облегчает выделение белка. Мортон [54] сообщил, что после предварительной обработки -бутиловым спиртом можно экстрагировать водными растворителями ряд ферментов, которые до сих пор считались связанными с нерастворимыми частицами , например такими, как митохондрии. Метод, повиди- мому, основан на удалении фосфолипидов. Результаты обработки отмытых мышечных остатков этиловым спиртом и эфиром перед выделением тропомиозина [55] или ацетоном, хлороформом и бутиловым спиртом перед выделением актина [56, 57] объясняют частичным отделением липидов, а также денатурацией других белков. [c.15]

Гетерогенность митохондриальной фракции привела де Дюва и других исследователей к необходимости разработки и использования для ее разделения центрифугирования в градиенте плотности i[1027]. Обычно центрифугирование проводят в градиенте концентрации сахарозы, хотя в растворах с высокой ее концентрацией и соответственно с высокой плотностью некоторые органеллы могут разрушаться. Используют также растворы с градиентом концентрации полисахаридов — высокомолекулярных соединений. С помощью этих методов удалось разделить митохондрии, лизосомы и пероксисомы и показать, что они содержат разные наборы ферментов. Эти органеллы не очень различаются по размеру (табл. 12.1) плотности указанных частиц из печени крысы в 0,25 М растворе сахарозы, примерно одинаковы и равны 1,100—1,103 для лизосом, 1,099 для митохондрий и 1,088—1,095 для пероксисом. Предварительная обработка животных препаратами, способными адсорбироваться клетками и накапливаться в лизосомах, приводит к уменьшению плотности этих органелл и при последующем выделении структур обеспечивает лучшее разделение их при центрифугировании. В настоящее время разработаны приемы, позволяющие разделять органеллы всех трех видов и получать их в больших количествах. [c.85]

Мы не можем утверждать, что в клетке есть только те органеллы, которые идентифицированы, выделены или обогащены с помощью описанных выше методов. Более того, гомогенность некоторых препаратов органелл вызывает сомнения. Бюфоидр. [332] показали, что окислительные ферменты и белки эндоплазматического ретикулума (ЫАОРН-цитохром с-редуктаза, цитохромы Ьъ и Р-450) могут быть локализованы на мембранах, способных частично отделяться от мембран, несущих гидролитические ферменты (глюкозо-6-фосфатазу, эстеразу, р-глюку-ронидазу). Неоднократно сообщалось о гетерогенности митохондрий, выделенных с помощью центрифугирования в градиенте плотности и дифференциального центрифугирования. Гетерогенность может проявляться в неравномерном распределении ферментов в популяции частиц или в других свойствах, таких, как проницаемость для сахарозы [3710] или способность включать аминокислоты [4082]. Причиной гетерогенности митохондрий может явиться также различие в их возрасте различия в размерах этих органелл могут приводить к различиям в соотношениях между площадью мембраны и объемом матрикса, что может также проявиться в гетерогенности некоторых свойств. [c.89]

Позже иммунохимические методы были использованы дл определения субклеточной локализации фитохрома в побегах овса и риса, выращенных в темноте. До облучения красным светом фитохром обычно распределен во всей цитоплазме и ее мембранах, а после короткого облучения выявляется лишь в определенных участках клетки. Видимо, эти участки — не ядра, не-пластиды и не митохондрии, а, возможно, эндоплазматический-ретикулум, разбросанный по всей цитоплазме. Длительное воздействие света приводит к появлению фитохрома также и в-ядрах. В пользу таких выводов говорят и эксперименты с изолированными субклеточными фракциями, однако не все исследователи согласны с интерпретацией полученных результатов. Данные физиологических экспериментов позволяют предполагать, что фитохром может находиться в клетке во многих местах в соответствии с его многочисленными функциями. По-видимому,, он локализован внутри этиопластов и митохондрий или в их наружных мембранах, так как изолированные органеллы реагируют на воздействие красным и дальним красным светом, произведенное после их выделения. [c.349]

Основным прибором цитологических исследований является световой микроскоп, до сих пор не утративший своего значения при изучении клетки. Существуют самые разнообразные модели световых микроскопов. Для каждого способа микроскопирова-ния необходимы свои методы приготовления препаратов. При изучении клетки под световым микроскопом многие ее структурные компоненты остаются незамеченными. Кроме того, при этом методе исследования живую клетку приходится обычно фиксировать (умерщвлять), дифференцированно ее окрашивать для выделения отдельных структур, что позволяет получить постоянные препараты хорошего качества, на которых отчетливо видно строение растительной клетки Однако в некоторых случаях фиксирующие агенты (спирт, кислоты, формалин, соли металлов) и красители могут исказить истинную картину клеточной структуры, заменив ее артефактами (структуры, созданные фиксирующим веществом). Б этом случае наряду с постоянными препаратами следует параллельно изучать живые клетки. Последние чаще всего окрашивают нейтральными красителями — цитоплазму, янусом зеленым — митохондрии, метиленовым синим — комплекс Гольджи. Используют и некоторые другие красители, сравнительно легко проникающие в живые клетк й. [c.7]

Для исследования ультраструктуры клетки используют метод, основанный на гомогенизации ткани или разрушении клеточных стенок и последующем разделении субклеточных структур (фракционирование). После фракционирования клеток и последуюш его выделения ядра, митохондрий и микросом остается растворимая фракция (надосадок), состоящая из растворимых белков и ферментов гиалоплазмы. В ней основными являются ферменты, принимающие участие в процессах гликолиза [c.27]

Генетической непрерывностью и способностью передавать генетическую инфррмацию обладают только ДНК и РНК- Устойчивые изменения генов хромосом связывают с изменением числа и порядка чередования нуклеотидов в ДНК и РНК- Можно было бы предположить, что и нехромосомные мутации имеют ту же биохимическую природу. Но обнаружить ДНК в компонентах цитоплазмы длительное время не удавалось. Лишь в последние годы ДНК была обнарул<ена в митохондриях и пластидах, Присутствие ДНК в этих органоидах доказано как методом авторадиографии, так и путем ее непосредственного выделения. [c.124]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология