Бактериофаги репликативная форма

Векторы на основе бактериофагов, содержащих одноцепочечную ДНК. Лучшие векторы такого типа разработаны на основе фага М13. В зрелую фаговую частицу входит одноцепочечная ДНК длиной 6500 нуклеотидов. После проникновения в клетку одноцепочечная ДНК фага превращается в двухцепочечную репликативную форму (РФ), которую выделяют из клеток и используют как вектор для клонирования. В инфицированной клетке накапливается 100—200 копий РФ ДНК. После этого синтез становится асимметричным и синтезируется лишь одна нить ДНК, которая входит в состав зрелого фага. Фаг М13 не убивает клетку, но лишь замедляет ее деление. Частицы зрелого фага непрерывно выделяются в среду, и их титр в культуральной жидкости может достигать 10 в 1 мл. [c.152]

Рис. 5.16. Использование бактериофага М13 для клонирования и секвенирования. А. Встраивание фрагмента ДНК в двухцепочечную репликативную форму ДНК М13. Б. Секвенирование комплементарных цепей клонированного фрагмента ДНК с помощью одного и того же праймера (Р1). Стрелками показана ориентация вставки в векторе.

Двухцепочечная кольцевая ДНК — ДНК, выделенная из вируса полиомы, бактериофага РМ2, митохондрий и хлоропластов. Как промежуточная репликативная форма, принимающая участие в биосинтезе линейной двухцепочечной ДНК. она обнаружена в составе бактериофага Я,. Некоторые плазмиды также содержат двухцепочечные кольцевые ДНК. [c.47]

Более того, в тех сравнительно редких случаях, когда генетический материал представлен однонитевой ДНК, как, например, у бактериофага фХ-174 и некоторых других, при их воспроизведении в клетке синтезируется так называемая репликативная (двунитевая) форма (РФ). Эта РФ далее реплицируется на основе полуконсервативного механизма. [c.125]

Одна из наиболее упо фебляемых схем такого мутагенеза приведена на рис. 85. С этой целью исходный ген встраивают в двунитевую репликативную форму ДНК фага М13, зрелые частицы которого содержат однонитевую кольцевую молекулу ДНК (плюс-цепь, см. 5.7). Введение полученной рекомбинантной ДНК в бактериальные клетки приводит к накоплению частиц бактериофага, содержащих однонитевую рекомбинантную ДНК, из которых ее можно выделить и использовать в качестве матрицы для ДНК-полимеразы. Для репликации используют специально сконструированный праймер, который соответствует участку встроенного гена, содержащему кодирующий элемент заменяемой аминокислоты. При этом по обе стороны от этого тринуклеотнда праймер полностью комплементарен рекомбинантной ДНК, а в пределах этого тринуклеотида заменен таким образом, чтобы в образующейся при репликации минус-цепи образовалась запла- [c.305]

Важную группу векторов, широко используемых прн установлении первичной структуры ДНК, составляют нитевидные бактериофаги, такие, как М13, fd и fl. Фаг М13 представляет собой одно-цепочечиую циклическую ДНК длиной около 6500 нуклеотидов. После инфицирования бактериальной клетки одноцепочечная ДНК фага превращается в двухцепочечную репликативную форму (RF), которая во всех отношениях подобна плазмиде. Кроме того, фаговая ДНК содержит короткий участок (500 нуклеотидов), названный межгенной последовательностью (МП), несущественный для ее жизнеспособности (рнс. 250). [c.432]

В некоторых других видах РНК также обнаружено формирование спиральных структур. Сообщалось, например, что комплементарная РНК (стр. 237), получаемая ферментативным путем in vitro на ДНК (как на матрице), выделенной из бактериофага Т2, содержит при определенных условиях высокоупорядоченную двойную спиральную структуру, сходную с таковой ДНК [74]. Однако это, по-видимому, не относится к информационной РНК, присутствующей в полисомах (стр. 281). Форму двойной спирали имеют также РНК различных вирусов, в том числе РНК реовируса раневой опухоли и репликативных форм вируса полиомиелита [36, 74, 75], вируса Сендай [76] и вируса эпцефаломиокардита [77]. Об этом свидетельствуют результаты, полученные при определении относительного содержания комплементарных оснований и при изучении тепловой денатурации о том же говорят и устойчивость к панкреатической рибонуклеазе и отсутствие реакции с формальдегидом, а также данные рентгеноструктурного анализа 178, 95]. [c.59]

Получены четкие доказательства (см. стр. 161 и 250) того, что репликация РНК вирусов сопровождается образованием дв х-ценочечной репликативной формы РНК. В качестве примера можно назвать репликативную форму РНК, образующуюся нри действии РНК-зависимой РНК-полимеразы (РНК-синтетазы) в клетках Е. oli, инфицированных РНК бактериофага MS2 (стр. 250). Эта РНК устойчива к рибонуклеазе, но нри нагревании до высоких температур (от 102 до 104°) наступают резкие изменения. При быстром охлаждении образуется чувствительное к действию рибонуклеазы вещество устойчивость к рибонуклеазе восстанавливается, если это вещество охладить до температуры ниже ее температуры плавления [79—84, 94]. При градиентном центрифугировании двухцепочечная форма характеризуется несколько меньшей плотностью, чем соответствующая одноценочечная. [c.59]

Кольцевая форма вирусной ДНК обнаружена также у двухцепочечной репликативной формы бактериофага ф Х174 (стр. 215), ДНК бактериофага % (стр. 161) и ДНК вируса нолиомы, которая существует и в виде кольца и в форме прямой цепи (49—51, 84). В последнем случае обе формы состоят из двойной цепи и обе они инфекционны. Кольцевую структуру можно наблюдать при помощи электронного микроскопа. Предполагается, что кольцевую форму имеет также ДНК бактериофага Т2 (стр. 157) [87]. [c.72]

Известны три типа двухцепочечных кольцевых ДНК- Первый из них — ковалентно замкнутая кольцевая ДНК. Такие ДНК имеют сравнительно небольшой молекулярный вес.Примером указанных ДНК служат нуклеиновые кислоты вирусов полиомы и ЗУ 40, репликативная форма ДНК бактериофага ФХ174 В их молекулах обе полинуклеотидные цепи не имеют ни единого разрыва, поэтому любое изменение вторичной структуры, связанное с изменением количества остатков на один виток спирали, влечет за собой перестройку третичного строения ДНК. [c.47]

Ковалентно замкнутая кольцевая двухцепочечная ДНК — особый тип макромолекулярной организации ДНК. Например, ДНК вируса полиомы и ЗУ 40 вируса, а также двухцепочечная репликативная форма ДНК бактериофага ФХ174. Такие ДНК характеризуются сравнительно небольшой мол. массой. Обе цепи в их молекулах не имеют ни одного разрыва, вследствие чего любое изменение спирали влечет за собой перестройку третичной структуры. [c.56]

Векторы на основе бактериофага Я. Бактериофаг Я. — это вирус, размножающийся на бактериях Е. соИ. За последние 3U лет он стал излюбленным и наиболее изученным объектом генетиков и молекулярных биологов. Геном фага Я. представлен двуцепочечной ДНК размером в 48,5 т.п.о., которая упакована в головку фага в виде линейной молекулы с однонитевыми комплементарными концами длинои в 12 п.о. (липкие концы). После проникновения в клетку липкие концы объединяются и ДНК замыкается в кольцо. Кольцевая ДНК является репликативной формой. Возможность создания векторов на основе фага Я связана с тем его свойством, что гены центральной части (от I до N) несущественны для литического развития. Уже более 20 лет известны способы замещения центральной части фага сегментами бактериальной хромосомы путем определенных генетических манипуляций in vivo. Созданные таким образом специализированные трансдуцирующие фаги хорошо изучены. Идея провести манипуляцию замены центральной части ДНК фага Я in vitro на чужеродные фрагменты послужила поэтому логическим продолжением опытов in vivo. [c.147]

Методы, используемые нами для синтеза равномерно меченных и меченных по концам одноцепочечных ДНК-зондов, очень похожи. Принцип их проиллюстрирован на рис. 10. Фрагмент ДНК, который предстоит исследовать, клонируется в репликативной форме бактериофага или в плазмидном векторе, продуцирующем одноцепочечные кольцевые молекулы только одной ориентации. Две наиболее распространенные системы такого типа — бактериофаг М13 и плазмиды, несущие точки начала репликации фага М13. Олигонуклеотидный праймер реассоциируют с одноцепочечной кольцевой молекулой так, чтобы он инициировал синтез ДНК на матрице тестируемой вставки в направлении от 5 - к З -концу. Для равномерно меченных зондов один из используемых при синтезе dNTP метится изотопами Р или в альфа-положении. Для зондов с концевой меткой олигонуклеотид метят по 5 -концу [y- PjATP, а для синтеза ДНК используют холодные dNTP. По окончании синтеза ДНК обрабатывается рестриктазой, расщепляющей кольцевую молекулу у конца вставки, противоположном сайту реассоциации с олигонуклеотидным праймером. В результате такой реакции получается линейный фрагмент ДНК, состоящий частично из двухцепочечного и частично из одноцепочечного участков. Денатурируя ДНК и проводя препаративный электрофорез в поли- [c.167]

В 1978 г. было опубликовано две работы [21, 38], показавшие, каким образом с помощью олигонуклеотидов можно осуществлять прецизионные изменения в структуре ДНК. В обеих работах мутациям подвергался геном бактериофага ФХ174. В зрелом вирусе ДНК этого фага находится в одноцепочечной форме, но при инфицировании перед образованием новых фагов превращается в двухцепочечную, или репликативную, форму (RF). Авторы [21, 38] использовали синтетические олигонуклеотиды, комплементарные к вирусной ( + ) цепи, в качестве праймеров для синтеза in vitro [c.102]

РИС. 2-23. А. Двойная спираль ДНК В-форма. (Arnott S., Hukins D. W. L.. JMB, 81, 93—105, 1975.) Б. Электронная микрофотография молекулы ДНК бактериального вируса (бактериофаг Т7) в момент ее репликации. Вирусная ДНК представляет собой длинный ( 14 мкм) дуплексный стержень, содержащий около 40 000 пар оснований. Виден небольшой репликативный глаз — участок, где происходит удвоение ДНК. Синтез ДНК начинается в особой точке (точке инициации), расположенной иа расстоянии, равном 17% длины молекулы, от одного из концов дуплекса. Окраска уранилацетатом негативное контрастирование. (С любезного разрешения Т. Wolfson [c.131]

Смотреть страницы где упоминается термин Бактериофаги репликативная форма: [c.206] [c.181] [c.541] [c.195] [c.868] [c.160] [c.238] [c.514] [c.39] [c.216] [c.246] [c.471] [c.270] [c.40] [c.108] [c.383] [c.40] [c.108] [c.49] [c.71] [c.222] [c.146]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология