также градиентная элюция

Хроматограмма аминокислот на колонке высокого разрешения (рис. 11) показывает возможность ускорения анализа обычных аминокислот, в связи с тем что эти аминокислоты (их пики на хроматограмме показаны жирной линией) отстоят достаточно далеко друг от друга (Кк 2). Поскольку, как это было показано выше, для рутинного анализа аминокислот Кв не должен превышать 2 единиц, имеется возможность сокращения длины колонки и, следовательно, времени анализа в 2—3 раза. Еще лучших результатов можно достигнуть, применив градиентную элюцию, позволяющую подобрать оптимальные условия для хроматографии смеси аминокислот, т. е. добиться ЛГд =2 для каждой соседней пары аминокислот и, кроме того, уменьшить ширину пиков. Использование градиентной элюции дает возможность также избавиться от ступенчатого повышения окрашенного фона (базовой линии) при смене буферного раствора, как это видно на рис. 11. Поскольку это повышение фона связано с десорбцией аммиака со смолы при резком повышении ионной силы и pH буферного раствора, то постепенное изменение состава элюента при градиентной хроматографии не должно вызывать указанного неприятного явления. [c.159]

Фосфодиэстераза яда гюрзы при градиентной элюции с СЭ-целлюлозы разделилась на две четкие фракции. Обе фракции были идентичными по ферментативным свойствам [54]. Возможно, что в этом случае также было ложное расщепление . [c.226]

Причиной различной способности белков вытеснять подвижные ионы может быть неодинаковое количество и природа заряженных групп в молекулах разных белков, а также влияние общих размеров и конфигурации белковой молекулы на прочность образующихся связей. Таким образом, уже на этой стадии происходит частичное фракционирование белковой смеси. Однако наиболее эффективным этапом разделения является следующая стадия процесса — элюция белков. Элюция достигается обычно введением раствора с высокой концентрацией солей (хлористого натрия, например). Ионы соли вытесняют связанные белки, причем в первую очередь элюируются белки, обладающие меньшим сродством к ионообменнику. В результате начальный эффект разделения белков резко усиливается. Наконец, можно еще больше усилить фракционирование, производя элюцию раствором с постепенно (или ступенчато) нарастающей концентрацией соли (градиентная элюция). Собирая элюат небольшими порциями, можно весьма полно разделить фракции. Для зтого широко применяют автоматические приемники элюата. [c.28]

Существует целый ряд автоматических коллекторов фракций, с помощью которых можно собирать определенные объемы элюата в автоматически сменяющие друг друга пробирки. Точное кол и-чество элюата в каждой фракции задается несколькими способами. Фракции можно собирать в пробирки либо по заранее заданному объему (с помощью системы сифонов или заменяющих их устройств), либо по числу капель — при помощи специального электронного устройства, контролирующего заполнение пробирок запрограммированным числом капель. Недостаток последнего метода заключается в том, что при изменении концентрации элюата (как это имеет место при градиентной элюции) изменяется поверхностное натяжение капель, а следовательно, и их объем при этом изменяется также и объем собираемых фракций. Другой способ заключается в том, что элюат собирают в каждую пробирку в течение определенного интервала времени. Однако и в этом случае объем отдельных фракций может быть неодинаковым, так как скорость протекания элюата по колонке не всегда постоянна. [c.109]

Важную роль в устройстве детектора играет рациональная конструкция кювет, исключающая возможность образования областей застаивания жидкости. Применяются как цилиндрические, так и прямоугольные кварцевые кюветы объемом в несколько десятков микролитров с длиной оптического пути от 2 до 10 мм. В конструкции УФ-детектора 11У-2 применена система одновременного прохождения света по двум путям (рис. 36) вдоль длины прямоугольной кюветы (20 мм) и в поперечном направлении (1 мм). Если такой прибор укомплектовать двухканальным регистратором (напрпмер, КЕС-482)> фирмы Р11агшас1а)>), то можно при одном и том же усилении сигнала с фотоэлементов вести регистрацию одновременно на двух значениях чувствительности, отличающихся друг от друга в 20 раз.. Это позволяет заметить пик малого поглощения и одновременно прописать форму интенсивных пиков от сильно поглощающих компонентов смеси веществ. Многие фирмы строят свои УФ-де-текторы по двухлучевой схеме прибор оснащается дополнительной кюветой сравнения, через которую может протекать чистый элюент, а луч света от лампы с помощью полупрозрачного зеркала расщепляется и проходит параллельно через две кюветы — рабочую и кювету сравнения. Двухлучевая схема позволяет исключить из регистрации собственное поглощение элюента, которое может изменяться в ходе градиентной элюции, а также кОдМпенсирует изменения яркости лампы, упрощая решение проблемы ее стабилизации. [c.83]

Хроматография гаироко применяется для разделения и очистки полинуклеотидов. Методы, разработанные для определения РНК и ДНК, будут рассмотрены в следующих главах подробное описание этих методов можно найти в соответствующих обзорах [32, 33]. При разработке методов хроматографирования были испытаны колонки из фосфата кальция [34—36], метилированного альбумина [37, 38], полиметакрилата магния (амберлит ШС-50) [39, 53] и като-2 (катионный крахмал) [54] наилучшие результаты были получены при использовании замещенных производных целлюлозы, например эктеола-целлюлозы (целлюлоза, обработанная апихлоргидрином и триэтаноламином) [19, 23, 31, 40—42] или ДЭАЭ-целлюлозы (диэтиламиноэтилцеллюлоза) [43, 44]. При использовании таких колонок наиболее эффективное разделение олигонуклеотидов, содержащих от двух до семи нуклеотидов, достигается путем градиентной элюции мочевиной. С успехом применяются также колонки с сефадексом, обладающим свойством молекулярного сита [45]. Для очистки информационной РНК употребляют колонки из ДНК [46, 47, 48, 49] (стр. 234). [c.34]

На рис. 12 показана хроматограмма 23 аминокислот с полным разделением пиков. Использование градиентной элюции позволило добиться равномерного обострения пиков на всей хроматограмме, что существенно сократило время анализа по сравнению со стандартным методом. Этот успех тем более значителен, что смола Дауэкс 50X12 имеет большие удерживаемые объемы по сравнению с Дауэкс 50X8 (рис. 2), и поэтому при обычной ступенчатой элюции время анализа должно быть больше, чем у Спекмапа, Штейна и Мура [6]. С другой стороны, если одновременно с увеличением будет увеличиваться также и АК, то, казалось бы, увеличение числа поперечных связей не должно влиять на время анализа t при заданном Кв. Тем не менее даже при сохранении постоянства отношения К / АК увеличение степени сшитости ионообменной смолы нецелесообразно, поскольку при этом уменьшается коэффициент диффузии (Д,), что в соответствии с уравнением (30) должно привести к увеличению времени анализа. На последнее обстоятельство обратили внимание авторы работы [29], показав, что уменьшение коэффициентов диффузии (О,) требует для сохранения необходимой для разрешения ширины полос уменьшения диаметра частиц и повышения температуры колонки. Тем не менее Пье и Моррис пошли на применение сильносшитой смолы, так как хотели предотвратить сжатие смолы при использовании элюентов с большой концентрацией ионов натрия ( 2,4 п.). Использование градиентной элюции позволило упростить аппарат не только по сравнению со стандартной методикой Штейна и Мура, но и с аппаратом, использованным Гамильтоном. [c.162]

Следует учитывать также, что условия рехроматографии никогда не бывают вполне идентичными таковым при первичной хроматографии смеси белков при рехроматографии отсутствуют белковые компоненты, которые могут играть роль компонентов-вытеснителей при первичной хроматографии кроме того, при повторном диализе перед рехроматографией могут быть устранены и некоторые низкомолекулярные примеси. В ряде случаев применение градиентной элюции может дать лучшее разделение компонентов смеси, чем ступенчатое. [c.227]

Regnier, 1983). Во многих случаях приемлемыми системами для элюции оказались градиентные растворы ацетонитрила, содержащие ион-парный агент ТФК в концентрации 0,1%. ТФК является сильной кислотой и помимо этого обладает целым рядом преимуществ 1) хорошо солю билизирует белки 2) относительно слабо поглощает в УФ-области 3) доступна в очищенном виде 4) легко удаляется при лиофилизации. Ацетонитрил обладает теми же достоинствами в отношении поглощения, чистоты и летучести и, кроме того, имеет очень низкую вязкость. При разделении белков используются также такие растворители, как 1- и 2-пропанол, несмотря на их более высокую, чем у ацетонитрила, вязкость. Они обладают большей гид-рофобностью, и поэтому в их присутствии белки можно элюировать при меньших концентрациях органических растворителей. [c.123]

В частично очищенных препаратах НАД-киназы из печени кролика также обнаружено несколько молекулярных форм фермента [6]. Электрофоретическое разделение в однородном и градиентном гелях с последующим выявлением места локализации НАД-киназы тетразолиевым. методом и элюцией фермента из отдельных участков столбика геля позволило выявить до 7 полос белка, проявляющих ферментативную активность. Молекулярные веса этих белковых зон оказались равными 650000, 400 000, 380 000—370 000, 300000—280000, 230000—210 000, 200000, 180000. В определенных условиях удавалось наблюдать переходы между формами. [c.140]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология