Химические методы гидролиза белков

Для определения размеров полипептидных цепей белковой молекулы разработаны специальные химические методы. Эти методы основаны на использовании особого реагента (динитрофторбензола), который соединяется со свободной аминогруппой аминокислотного остатка на конце полипептидной цепи с образованием окрашенного комплекса этот комплекс можно выделить и идентифицировать после того, как белок подвергнется гидролизу и распадется на составляющие его аминокислоты (в том числе и на концевую аминокислоту с присоединенной к ней окрашенной группой). Так, было показано, что один из типов молекул гемоглобина, обнаруженный в красных кровяных тельцах большинства взрослых людей (называемый гемоглобином А), содержит четыре полипептидные [c.680]

Одним из наиболее распространенных методов исследования химического состава белковых тел является гидролиз. Белок нагревают с растворами кислот или щелочей при температуре 100—105° С примерно в течение суток. Чаще всего используют 20%-ный раствор НС1, обеспечивающий глубокий гидролиз белка с минимальным разрушением аминокислот, из которых он построен. В последнее время для ускорения реакции гидролиза белков используют иммобилизованные (закрепленные на носителях) протеолитические ферменты и ионообменные смолы, что обеспечивает полное соответствие содержания аминокислот в гидролизате соотношению их в белке. [c.38]

Химическое, и, тем самым, биологическое поведение белка определяется его аминокислотным составом и последовательностью остатков в цепи — первичной структурой. Современные методы позволяют определить аминокислотный состав белка без особых затруднений. Белок расщепляется на аминокислоты в результате гидролиза — реакции, обратной поликонденсации, [c.69]

Создание твердофазных носителей для анализа последовательности [55] стимулировало разработку мощного метода селективного выделения С-концевых пептидов. В принципе можно селективно присоединить белок к смоле через С-концевой карбоксил белка, химически или ферментативно расщепить иммобилизованный белок и селективно выделить С-концевой пептид, поскольку после гидролиза только он останется присоединенным к смоле. Однако на практике при активации С-концевого карбоксила активируются и карбоксильные группы боковых цепей Asp и Glu, которые затем связываются с носителем [51], что ограничивает возможности использования таких смол в качестве общего метода селективного выделения С-концевых фрагментов белков. [c.483]

Свойства белков, положенные в основу данного метода, служат хорошей иллюстрацией групповой специфичности протеиназ, заключающейся в том, что фермент катализирует расщепление определенных химических связей в отдельных группах близких, по строению веществ (протеиназы растений гидролизуют и белок ки-вотного происхождения). [c.181]

Последовательность аминокислотных остатков в полипептид-,ной цепи называется ее первичной структурой. Определение пер.-вичной структуры производится путем частичного гидролиза белка с помощью специфических протеаз, катализирующих расщепление пептидной связи лишь между определенными остатками. Так, трипсин атакует лишь те пептидные связи, которые образованы СО-группами остатков основных аминокислот — Apr или Лиз. В результате образуется смесь коротких полипептидных цепей, олигомеров. Такие короткие цепи называются пептидами. Их исследование производится посредством химических и физико-химических методов (хроматография, масс-спектроскопия). Воздействуя другим ферментом, можно разрезать белок по другим связям, получить смесь других пептидов. N- и С-конце-вые остатки белка (см. стр. 68) определяются в результате их химической модификации, предшествующей частичному гидролизу. Зная строение пептидов, полученных при специфическом расщеплении различными ферментами, можно установить первичную структуру белка. Допустим, что белковая цепь имеет структуру [c.73]

Разработаны химические методы определения величины полинептидных цепей белковой молекулы. Эти методы основаны на использовании особого реагента (динитрофторбензола), который соединяется со свободной а-амино-грунной аминокислотного остатка, стоящего на конце нолипептидной цепи, с образованием окрашенного комплекса этот комплекс можно выделить и идентифицировать после того, как белок подвергнется гидролизу на составляющие его аминокислоты (в том числе и на конечную аминокислоту с присоединенной к ней окрашенной группой). Так, лизоцим, белок, содержащийся в слезах и яичном белке и обладающий свойством уничтожать бактерии, имеет, как было установлено ири помощи ультрацентрифуги, молекулярный вес около 14 ООО и состоит примерно из 125 аминокислотных остатков. Применение описанного метода позволило показать, что имеется лишь одна свободная а-аминогруппа, и на этом основании был сделан вывод, что данная молекула состоит из одной нолипептидной цепи. Если эта полипептид-ная цепь была бы растянута, то ее длина составляла бы около 450 А. Однако, как установлено при помощи ультрацентрифуги, дифракцией рентгеновских лучей и другими методами исследования, молекула лизоцима по форме близка к шару с диаметром около 25 А. Отсюда следует, что нолипептидная цепь не может быть вытянутой, а должна быть скрученной, ибо только тогда молекула приобретет сферическую форму. [c.487]

В результате ферментативного воздействия, определяли последовательно после каждого отщепления Ы-концевого остатка по методу Эдмана (см. гл. 6). При изучении гемоглобина (Брауницер был удачно применен последовательный гидролиз белка разными про-теолитическими ферментами. В этом случае на белок действовали трипсином, а затем полученные пептиды гидролизовали пепсином, специфичность которого значительно повышали, ограничивая время реакции. Методические трудности, связанные с фракционированием сложных гидролизатов и определением полной структурной формулы белка, были преодолены в результате упорного труда нескольких групп ученых. Мы теперь знаем полную аминокислотную последовательность инсулина, глюкагона, рибонуклеазы, гемоглобина, белка вируса табачной мозаики, а также кортикотропина и других пептидных гормонов приближаются к завершению работы по установлению строения папаина, лизоцима, химотрипсиногена, трипсииогена, цитохрома с успешно продвигается изучение некоторых других белков. Изучение последовательности аминокислот проводилось на частичных кислотных гидролизатах или на гидролизатах, полученных при действии различных протеолитических ферментов. Чисто химические методы избирательного расщепления пептидных цепей не имели до сих пор значительного успеха, и эта область остается еще нерешенной задачей пептидно химии. [c.117]

Блестящие исследования английского химика Ф. Зан-гера, о которых будет идти речь ниже в статье Э. Томпсона, подтверждают эффективность этих методов. Зан-геру удалось установить полностью строение важного белкового гормона — инсулина. В основе его исследования лежало применение химического реактива — дини-трофторбензола. Это вещество легко присоединяется к альфа-аминогруппам на концах пептидных цепей инсулина. В результате этого присоединения образуется вещество, называемое динитрофенил-инсулином (ДНФ-инсулин). Все концевые альфа-аминогруппы в этом соединении заняты динигрофенильными (ДНФ-) группами. Если белок подвергнуть гидролизу с помощью сильной кислоты, то все пептидные связи разрываются, только связи между ДНФ-группой и альфа-аминогруппами концевых аминокислот остаются в основном ненарушенными. Другими словами, каждая концевая аминокислота остается связанной с ДНФ-группой. Так как любое вещество, в котором присутствует ДНФ-группа, окрашено в отчетливо желтый цвет, то Зангеру удалось разделить ДНФ-аминокислоты путем хроматографии и определить последовательность, в которой они связаны в пептидных цепях молекулы инсулина. [c.72]

Определение химической структуры белка следует начинать с количественного анализа аминокислотного состава его полипептидных цепей. Для этого чистый и, если это возможно, кристаллический белок подпер-гают обычно кислотному гидролизу, чтобы гидролизовать все имеющиеся в белке пептидные связи, которые соединяют аминокислоты, входящие в состав этого белка. Затем определяют относительные количества высвобождающихся при таком гидролизе двадцати стандартных аминокислот. Определение количества аминокислот проводят с помощью метода хроматографии на ионообменных смолах, разработанного в начале 50-х годов У. Штейном и С. Муром (фиг. 39, 40). Результаты такого анализа аминокислотного состава двух ферментов Е. oli (Р-галактозидазы и триптофан-синтазы) приведены в табл. 2. (Триптофан-синтаза Е. соН, как скоро будет показано, состоит из двух различных полипептидных цепей, названных А-белком и В-белком. Данные, приведенные в табл. 2, касаются только А-белка.) [c.83]