Нуклеотидная последовательность и концевые группы

Известная специфичность ферментов позволяет воссоздать некоторые частичные последовательности полинуклеотидной цепи. Далее проводят расщепление исходного полинуклеотида на более крупные блоки (чаще всего для этой цели применяют частичный гидролиз гуанил-РНК-азой) и отыскивают в них участки нуклеотидных последовательностей, позволяющие однозначно расставить в полинуклеотидной цепи фрагменты, полученные ранее, и воссоздать таким образом полную структуру полинуклеотида. Существенным моментом для успеха такой реконструкции является присутствие в нуклеотидной последовательности уникальных участков, которые могут быть использованы как отправные точки. Для этой цели можно использовать концевые группы, а также редкие компоненты или олигонуклеотиды, встречающиеся в продуктах ферментативного гидролиза полинуклеотида только один раз. [c.73]

Введение метки по концевым фосфатным группам нуклеиновых кислот используется для анализа нуклеотидных последовательностей в концевых участках полинуклеотидов (см. гл. 1). [c.597]

НУКЛЕОТИДНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ И КОНЦЕВЫЕ ГРУППЫ [c.386]

I и И1 предсказана на основании нуклеотидной последовательности соответствующих структурных генов митохондриальной ДНК (Ф. Сейгер и др.). Молекула цитохромоксидазы содержит, по-видимому, по одной копии большинства субъединиц. Биосинтез трех больших субъединиц (I—111) происходит в митохондриях, остальные субъединицы синтезируиугся в цитоплазме в виде предшественников с N-концевыми сигнальными последовательностями (от 2 ООО до 6 ООО), необходимыми для транспорта через мембрану. Детали процесса самосборки активного комплекса из отдельных субъединиц пока не выяснены. Считается общепризнанным, что субъединицы 1 и II участвуют в связывании простетических групп (гемов и ионов меди) и образовании 4 окислительно-восстановительных центров. Точная локализация простетических групп в апобелках затруднена, так как они ие связаны ковалентно с аминокислотными остатками этих белков и легко теряются при выделении субъединиц. [c.617]

В ряде опытов был изучен фосфоролиз, т. е. обращение реакции полимеризации [158, 166, 168]. Для этого используемый полинуклеотид инкубировали с ферментом в присутствии избытка неорганического фосфата, что приводило к образованию нуклеозиддифосфатов в результате последовательного отщепления моно-нуклеотидных единиц. Оказалось, что легко фосфоролизируются не только полимеры, полученные путем биосинтеза, но и обладающие затравочной активностью олигонуклеотиды. Динуклеотиды же и динуклеозидмонофосфаты, как и следовало ожидать, не поддаются фосфоролизу. РНК вируса табачной мозаики и высокополимерная РНК дрожжей могут легко подвергнуться фосфоролизу, но если дрон<жевую РНК предварительно обрабатывают щелочью, то фосфоролиз протекает медленно. Медленно протекает и фосфоролиз многочисленных тяжей, образованных, например, из поли-А и поли-У. Неполностью (па 20—30%) протекает фосфоролиз транспортной РНК клеточной цитоплазмы, что можно объяснить особенностями вторичного строения s-PHK. По-видимому, фосфоролиз затрагивает преимущественно концевые группы. [c.256]

РНК, концевые группы — нуклеотидные остатки или их последовательности на двух противоположных концах полирибонуклеотидной цепи. Существуют различные приемы определения концевых групп в полинуклеотидных цепях. Например, при использовании высокоочищенных препаратов фосфодиэстеразы змеиного яда в продуктах гидролиза РНК в основном обнаруживаются нуклеозид-5 -ионофосфаты, но наряду с ними содержится также небольшое количество пуриновых нуклеозидов и пиримидиновых нуклеозиддифосфатов. Механизм такого гидролиза схематически изображен на рис. 26. Из этого рисунка следует, что с левого конца цепи отщепляется нуклеозид, с правого —нуклеознд-3, 5 -ди( юсфат. Нуклеозид-5 -фосфаты образуются из внутреннего отрезка полинуклеотидной цепи. [c.78]

Используя совокупность указанных методов, удалось определить нуклеотидную последовательность суммарной тРНК с акцепторного конца, т. е. с конца, несущего свободную З -ОН-группу, к которой присоединяется аминокислота. Найдено, что все известные тРНК имеют один и тот же, концевой тринуклеотид [c.427]

По данным анализа концевых групп аминоконцы белков оболочки Р1 и 1А блокированы [159, 327]. В результате радиохимического секвенирования полиовирусных белков, которое стало возможным после определения нуклеотидной последовательности генома, была получена такая же карта, как и в ранних исследованиях [272]. Кроме того, было установлено точное расположение сайтов расщепления и показано, что продукты не подвергаются последующему укорачиванию [159, 231]. [c.233]

Существует также большое число ферментов, аналогичных полимеразам, но способных к безматрнчному синтезу полинуклеотидов. Из них наибольшее применение нашла концевая дезокси-нуклеотидилтрансфераэа (терминальная трансфераза). Концевая нуклеотидилтрансфераза (из тимуса теленка) осуществляет последовательное присоединение нуклеотидных звеньев к З -ОН-кон-цевым группам ДНК. Субстратами служат дезоксирибонуклео- [c.351]

Если олиго- или полинуклеотид фосфорилирован по З -концу, первой стадией является ферментативное дефосфорилирование. Затем следует периодатное окисление, превращающее З -концевой нуклеозидный остаток в 2, 3 -диальдегид XVI, в котором 5 -фосфо-диэфирная связь находится в р-положении к З -альдегидной группе (подробнее о периодатном окислении см. стр. 531). Завершающей стадией является расщепление 5 -фосфоэфирной связи в диальде-гидном производном XVI под действием различных первичных аминов. В результате образуется олиго- или полинуклеотид, укороченный с З -конца на одно нуклеотидное звено. Весь цикл превращений может быть повторен. От продукта превращения бывшего З -концевого нуклеотидного звена XVII при действии кислоты (рН< 3) или щелочи (pH > 11) отщепляют основание, определяемое далее обычными аналитическими методами. Разрешающая способность метода (возможность определять достаточно длинную З -концевую последовательность олигонуклеотида или РНК) зависит от полноты прохождения каждой стадии реакции. Важнейшей из этих стадий является расщепление фосфодиэфирной связи в диальдегиде XVI под действием аминов. Первоначально для этой цели использовали глициновый буфер (pH 10—10,5 37° С, 18 ч) 175,176 Хаким методом была проведена ступенчатая деградация 3 ряда динуклеотидов [c.588]

В результате таких превращений фосфодиэфирные связи концевых нуклеотидных звеньев активируются образовавшейся 3-кар-бонильной группой и могут быть расщеплены по механизму р-эли-минации. Идея такого метода ступенчатой деградации ДНК впервые была высказана Тоддом и Джонсом В настоящее время возможность осуществления последовательной деградации ДНК показана, однако, лишь на уровне мононуклеотидов и небольших олигонуклеотидов. [c.591]

Хотя на данном этапе методы химического гидролиза не позволяют сделать выбора между 3 —5 - и 2 —5 -межнуклеотидными связями, доказательства, по-видимому, исключительного присутствия 3 —5 -структуры были получены на основании исследований ферментативного гидролиза рибонуклеиновых кислот и простых нуклеотидных производных. Из различных источников был выделен ряд нуклеаз, которые катализируют гидролиз нуклеиновых кислот на более мелкие фрагменты. Панкреатическая рибонуклеаза [93] — один из группы ферментов, обнаруживающих высокую специфичность к рибонуклеиновым кислотам,— была тщательно изучена и дано объяснение механизма ее действия. Ранние исследования показали, что фермент действует по пиримидиннуклеозидным звеньям, так как крупные педиализуемые остатки после ферментативного расщепления рибонуклеиновой кислоты значительно обогащены пуринами [94] кроме того, выделяются пиримидиновые мононуклеотиды, но не обнаружено свободных пуриновых мононуклеотидов [75, 95, 96]. Дальнейшие исследования кислотного или щелочного гидролиза продуктов, полученных в результате последовательной обработки рибонуклеиновой кислоты рибонуклеазой и фосфомоноэстеразой предстательной железы, привели к заключению, что специфичность рибонуклеазы такова, что нуклеиновые кислоты расщепляются ею с образованием смеси пиримидиновых мононуклеотидов и пуриновых олигонуклеотидов, содержащих в качестве концевой единицы пиримидиновый нуклео-зид-2 (или 3 )-фосфат [75, 97]. [c.377]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология