Гибридизация в агаре

Опыты по гибридизации позволили исследовать гомологичность нуклеиновых кислот из разных источников. Вначале молекулы расщепляют (например, с помощью ультразвука) на фрагменты длиной 1000 нуклеотидов и подвергают денатурации. Фрагменты денатурированной ДНК смешивают с денатурированной ДНК из другого источника. Участки ДНК разных видов, имеющие близкие нуклеотидные последовательности, в той или иной степени гибридизуются, тогда как участки с сильно различающимися последовательностями гибридизации не поддаются. Рассмотрим один из вариантов постановки таких экспериментов. Денатурированную ДНК определенного организма, не подвергавшуюся деградации, заключают в агаровый гель [90] или наносят на нитроцеллюлозный фильтр [91]. Фрагменты ДНК из другого источника пропускают через колонку с ДНК-содержащим агаром или через фильтр с абсорбированной ДНК. Комплементарное спаривание соответствующих фрагментов задерживает их на колонке или фильтре, тогда как фрагменты, не нашедшие себе партнеров , свободно проходят дальше. [c.143]

Гели с иммобилизованной ДНК применяют в качестве неподвижной фазы, например при гибридизации в агаре [126], при выделении кодирующей нити ДНК [127]. ДНК, связанную с различными носителями, можно использовать для очистки ДНКаз [122—130] или других ферментов, участвующих в метаболизме и биосинтезе ДНК (полимераз, лигаз и т. п.). [c.82]

Гибридизация РНК с ДНК, закрепленной в агаре. Принцип этого метода был разработан Болтоном и Маккарти [14], [21] (см. стр. ИЗ). [c.115]

При использовании чашек LB пятна гибридизации получаются сильнее, чем при использовании чашек для фага X, хотя бляшки на первых и оказываются мельче. Допустимое число бляшек на чашку зависит от размера бляшек. Если бляшки на чашке сливаются, то пятен гибридизации видно не будет. Поскольку размер бляшек обратно пропорционален количеству высеваемых для газона клеток, то при необходимости можно сделать бляшки нужной величины. Использование подсушенных чашек снижает вероятность захвата частиц верхнего агара на этапе 6. [c.119]

Если гибридомные клетки выращивали в панелях для культуры тканей с объемом лунок 2 мл (процедура гибридизации Б), а клонирование проводили в мягком агаре, как описано выше, то в некоторых случаях необходимо было проанализировать большое число колоний, прежде чем удалось обнаружить антителообразующую колонию. По этой причине клонирование проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах для микротитрования с помощью последовательных разведений клеточной взвеси. Преимущество такого подхода заключается в том, что образование антител единичными колониями, растущими в лун- [c.140]

Три фильтра-реплики, полученные от каждого исходного фильтра (два набора на агаре L-амп, один на агаре HMF-1 амп), подращивают при 37°С до тех пор, пока диаметр колоний не станет равным 1 мм. Первые два набора используют для скрининга библиотеки с помощью гибридизации (см. ниже), в то время как третий набор, инкубированный в чашках с агаром HMF-1 амп, переносят в чашки с агаром HMF-2 амп и оставляют на 2 ч при комнатной температуре. Чашки кладут [c.26]

Фильтры инкубируют в большой стеклянной чашке Петри, покрытой стеклянной пластинкой, как описано ранее (разд. IV, А). Для гибридизации используют супернатант от исходного скрининга (разд. IV, Б), который прогревают 10— 15 мин при 70 °С для денатурации ДНК и охлаждают в смеси воды и льда. После гибридизации фильтры отмывают, экспонируют и отбирают на них одиночную, находящуюся на достаточном расстоянии от других положительную колонию (разд. IV, В—Д). Положительный клон высевают штрихом в свежую чашку с агаром L-амп и подготавливают ночную культуру для выделения ДНК в среде L-амп. [c.31]

Другое назначение мембран из нитроцеллюлозы применительно к технологии рекомбинантных ДНК заключается в обнаружении молекул специфической ДНК в бактериальных колониях, выращиваемых в чашках с агаром (рис. 11.14). С помощью соответствующего раствора ДНК освобождается из бактериальных колоний или вирусных бляшек. Затем над колониями помещают листовую мембрану из нитроцеллюлозы, и некоторое количество свободной ДНК переносится на мембрану. При использовании в виде зондов радиоактивных РНК и ДНК точное расположение на мембране искомой ДНК определяется гибридизацией и последующей авторадиографией. Соответствующая колония на исходной чашке после этого переносится для дальнейшего изучения. [c.325]

Гибридизация ДНК-ДНК с использование агарового геля сводится к следующему. Берут 400 мг сухого очищенного тугоплавкого агара фирмы Дифко или ионагар № 2 (можно № 3) фирмы Оксойд и суспензируют ъ Ъ мл 4XSS . За несколько минут до начала опыта его расплавляют на кипящей водяной бане и получают 8%-ный агар. Одновременно денатурируют препарат нативной ДНК. С этой целью 5 мг ДНК в 5 мл 0,1 X SS кипятят 10 минут при 100° и быстро охлаждают в ледяной бане. [c.113]

Зерна ДНК-геля переносят в термостатированную колонку со стеклянным пористым фильтром у дна и промывают несколькими порциями 4 X SS при 60°. Промытые зерна ДНК-агаро-вого геля хранят при 4° в 4XSS . Концентрацию ДНК в геле находят спектрофотометрическим методом после растворения навески геля путем кипячения в 5 М Na 104. Стандартные препараты ДНК-агарового геля содержат обычно 400 у ДНК на 1г сырого агара. I Для гибридизации берут 0,5—1 г ДНК-агара (сырой вес) и смешивают с 1 мл (20—50 у на 1 мл) денатурированной и фрагментированной непосредственно перед гибридизацией раствор фрагментированной ДНК денатурируют нагреванием, быстро охлаждают и доводят концентрацию растворителя с помощью 10 X SS до 4 X SS . [c.114]

Гибридизацию меченых фрагментов ДНК с ДНК-агаром ведут в стеклянных флаконах с притертой пробкой в термостате при 60° в 4XSS в течение 16—18 часов. При этом-следят за тем, чтобы зерна геля во время инкубации находились бы в растворе 4 X SS . [c.114]

ДОМ вегетативной гибридизации. Asp. niger S4 на твердых средах дает обильный рост и образует большое количество конидий. На агаре колония его имеет коричневый цвет с белой каймой в агар выделяется немного ярко-желтого пигмента. В глубинной культуре на барде с добавлением 2% муки и 0,25% магнезита (в лабораторных опытах на качалке) штамм Asp. niger S4 обладает активностью до 1700—1900 ед. ДС, 200—250 ед. МС и 30—40 ед. АС. [c.149]

Этот метод сходен с гибридизацией на ДНК-целлюлозе. Нодробио он обсуждается в работе Бендика и Болтона [5]. Метод заключается в том, что крупные фрагменты ДНК заплавляют в агар, ДНК-агар инкубируют с раствором РНК, смесь переносят в хроматографическую колонку и гибриды очищают, промывая колонку растворами солей различной концентрации при различной температуре. [c.150]

Рис. 5-83. Эффективный метод, широко применяемый для выявления бактериальной колонии, содержащей определенный клон ДНК (см. также рис. 5-79). Каждая бактериальная клетка, несущая рекомбинантную плазмиду, дает начало колонии из идентичных клеток, которая на питательном агаре выглядит как белое пятнышко. Прижимая к поверхности чашки кружок из фильтровальной бумаги, получают реплику бактериальной культуры. Эту реплику обрабатывают щелочью, чтобы разрушить прилипшие к бумаге клетки и денатурировать плазмидпую ДНК, а затем проводят гибридизацию с высокорадиоактивным ДНК-зондом. Колонии бактерий, связавшие ДНК-зонд, выявляют методом радиоавтографии.

Чистую культуру выделяют из отдельных колоний, полученных на агаризованной среде Эшби или картофельном агаре N 26 после посева на эти среды накопительной культуры. Чистоту культуры проверяют по характерным признакам роста на указанных вьпие средах, по отсутствию роста на МПА и МПБ, по морфологическим признакам вегетативных клеток и спор. Идентификацию проводят на основании признаков, отмеченных в табл. 1.16 (глава 1),а также путем ДНК- ДНК гибридизации с другими ни-, дами рода Ba illus. [c.64]

В том случае, когда клетки после слияния рассевают в лунки панели для культуры ткани объемом 2 мл, вероятность того, что в одной лунке окажется более одного клона, повышается. Просматривая культуры под инвертированным микроскопом, можно наблюдать два и более клонов в лунке. Клонирование клеток, продуцирующих антитела нужной специфичности, предпринимают немедленно после образования монослоя (обычно па 21—28-е сутки после гибридизации). Тем не менее гибридо-ыу продолжают наращивать в нескольких лунках, а затем во флаконах, пока не образуется достаточное для замораживания и хранения в жидком азоте количество клеток. Необходимо иметь, по меньшей мере, пять ампул исходной клеточной взвеси на случай, если возникнут трудности или неудачи при клонировании. Во время культивирования гибридомы во флаконах культуральную среду тестируют для выявления антител нужной специфичности. Если наблюдается прогрессирующее сни-жение образования антител на стадии роста культуры во флаконах, то это означает, что несекретирующие варианты гибридных клеток обогнали в росте антителообразующие клетки, В таком случае важно отобрать антителообразующие гибрид ные клетки путем клонирования, а небольшое количество клеток из этих флаконов сохранить для последующих процедур клонирования. Клонирование клеток из тех флаконов, где а культуральной среде выявляют прогрессивное снижение образования антител, почти всегда безуспешно. Если все же очень важно выделить такую клеточную линию, то следует извлечь из жидкого азота и разморозить образец клеток, замороженный на самой ранней стадии культивирования и сразу же после восстановления клеток в культуре провести клонирование. Клони-рование может быть осуществлено либо путем высевания небольшого количества клеток в мягкий агар, либо с помощью лимитирующих разведений. [c.139]

Из каждой клеточной суспензии делают разведения 10 , 10 и 10" на среде L-амп (по 1 мл каждого). По 200 мкл каждого разведения наносят на /з площади фильтра (Grosveld et al., 1981), начиная с низшего. Дают возможность среде впитаться в агар, после чего инкубируют чашки агаром вверх в течение ночи. Минимальное разведение должно дать несколько колоний, хорошо отделенных друг от друга. На следующий день готовят один набор фильтров-реплик по прописи, приведенной в разд. III, И, также с использованием фильтров Miilipore. При повторном скрининге обычно нет необходимости готовить второй набор фильтров для гибридизации. После подрастания реплицированных бактерий (обычно около 6 ч при 37 °С) клетки лизируют на фильтрах-репликах, которые далее проводят через этапы денатурации и связывания ДНК, как описано в разд. III, К. Исходные фильтры хранят при 4 °С и используют для последующего отбора положительных колоний. [c.31]

Ксеногенная иммунизация животных клонированными популяциями жизнеспособных клеток лимфомы приводит к активации и увеличению числа клеток, способных продуцировать антитела к чужеродным антигенам мышиных лимфом. С помощью соматической гибридизации получают иммортализованные антителосинтезирующие клоны и из них отбирают (тестируя антитела на способность связываться с клетками) только те, которые секретируют антитела против антигенных детерминант клеточных поверхностей. Культуры, которые содержат клетки, продуцирующие МА, клонируют в мягком агаре и подвергают повторному тестированию на способность связываться с клетками большого числа линий, представляющих различные стадии и направления дифференцировки. [c.176]

Этот вариант скрининга обусловлен низким выходом интересующего рекомбинантного клона. Высев колоний в этом случае можно производить до нескольких десятков тысяч на 90-мИ чашку (лучше не более 30 ООО). Вместо нитроцеллюлозы для переноса бактериальных клонов лучше использовать бумагу Whatman 542 (или 540, 541), так как в этом случае не требуется исключительных навыков по одергиванию колоний с агара и, в отличие от НЦФ, не возникает проблем с неполным или неравномерным отпечатыванием колоний на фильтре. Гибридизацию зовда с ДНК, иммобилизованной на бумажных фильтрах щюводят гак же, как и в случае с НЦФ (см. далее). [c.32]

Фильтр осторожно снимите с агара, чашку закройте и поставьте в термостат на 37 С. Через 1-2 суток матричную чашку достаньте из термостата, згшотайте парафильмом и храните в холодильнике до получения результатов гибридизации. [c.33]

Каждая бактериальная клетка, несущая рекомбинантную плазмиду, дает начало колоьши из идентичных клеток, которая на питательном агаре выглядит как белое пятнышко. Прижимая к поверхности чашки кружок из фильтровальной бумаги, получают реплику бактериальной культуры. Эту реплику обрабатывают щелочью, чтобы разрушить прилипшие к бумаге клетки и денатурировать плазмидную ДНК, а затем проводят гибридизацию с высокорадиоактивным ДНК-зондом. Калонии бактерий, связавшие ДНК-зонд, выявляют методом радиоавтофафии. [c.332]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология