Надосадочная жидкость из культур клеток

Рис. 2. Прямой анализ продуктов, секретируемых гибридными клетками. Культуры гибридом получали, проводя слияние спленоцитов мышей, иммунизированных линией опухолевых клегок человека, с клетками мышииой мне ломы Х63-Аё8. Взвесь, содержащую 5-10 клеток гибридомы в 1 мл, культивировали в течение ночи в полной среде для тканевых культур в присутствии 100 мкКи/мя 5-метионина. Культуральную жидкость центрифугировали 15 мин при 20 000 Затем 100 мкл надосадочной жидкости смешивали перед ДСН-ПАГЭ с 50 мкл 3-кратного концентрата ДСН-буфера для образца. На гель наносили пробы по 50 мкл. Электрофорез проводили при постоянном токе 25 мА на пластинку геля в течение 3,5 ч. Т и Л —соответственно тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов 1 и — окрашенные элек трофореграммы и радиоавтографы одних и тех же образцов. Стрелками указаны легкие цепи пмм ко лобулино8, кодируемые геномом клеток Х63-Ай8.

Рис. 2. Секреция 1дО-подобных иммуноглобулинов восемью клопами одной перевиваемой линии лнмфобластондных клегок человека. Клеточную суспензию культуры (2-10 клеток/мл) метили в процессе биосинтеза в течение 12 ч С-лейцином (1,5 мкКи/мл). Надосадочные жидкости каждой культуры инкубировали в течение ночи при 4°С с кроличьей антисывороткой к б-цепям человека и с убитой суспензией стафилококков, несущих белок А. Клетки стафилококка и иммунные комплексы осаждали и отмывали 3 или 4 раза ЗФР, центрифугируя 10 мин при бОООд. Осадки суспендировали в буфере для нанесения и инкубировали 3 мин при 100°С. Затем проводили электрофорез в 12,5%-НОМ геле при силе тока 20 мА на пластинку. Гель фиксировали, окрашивали, обесцвечивали и высушивали на фильтровальной бумаге. Высушенную пластинку геля экспонировали на медицинской рентгеновской плеике Ко(1 гех. Полученные полипептиды имели приблизительно следующие молекулярные веса а — 63 000 Ь — 55 000 с — 51 ООО ё — 28 000 е — 25 000 / — 24 ООО.

Молодую бульонную культуру испытуемого микроорганизма центрифугируют и надосадочную жидкость сливают. Клетки суспендируют в ФСБ и вновь центрифугируют. К осадку добавляют небольшое количество ФСБ, чтобы получилась густая суспензия клеток. С помощью алмазного или карбидно-вольфрамового карандаша очерчивают круг диаметром /4 размера предметного стекла. Стекло тщательно обезжиривают и внутри окружности делают мазок одной петлей бактериальной суспензии. Мазок высушивают на воздухе без нагревания, помещают предметное стекло на 1 мин в сосуд с 95%-ным этанолом, вынимают его и сушат на воздухе. [c.67]

Культуру выращивали на МПА в течение 24 ч при температуре 37°. Клетки трижды отмывали физиологическим раствором (0,56%) и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 20 мин, 10 г сырой биомассы разрушали с помощью гомогенизатора Л-17 [187] в рефрижераторной центрифуге при температуре 4° в фосфатном буфере (pH 7,0). Бесклеточный экстракт, представляющий собой надосадочную жидкость, после центрифугирования гомогената клеток, активно дезаминирует ГМД 5-минутного контакта бесклеточного экстракта с 1%-ным раствором ГМД в соотношении 1 1 достаточно для полного разрушения токсического вещества. При этом наблюдается [c.181]

Для получения максимальной продукции моноклональных антител клеткам позволяют расти до предельной плотности. В такой культуре через определенное время наблюдается гибель гибридомных клеток. Надосадочная жидкость собирается, а клеточный осадок отбрасывается, т. е. не пытаются культивировать дальше оставшиеся в живых клетки. [c.117]

Клетки Е. соИ, меченные 2 р полученные из 1 л культуры (1 г сырого веса), помещают в охлажденную ступку, добавляют к ним 2,5 г окиси алюминия и 0,1 мл раст вора, содержащего 100 мкг ДНК-азы, и растирают 10-15 мин, пока грубая порошкообразная масса не станет жидкой пастой. Затем туда добавляют 5 мл ТМА (-2)-буфера и продолжают растирание еще 5 мин. Густ5гю суспензию центрифугируют 15 мин при 17 ООО , после чего надосадоч-ную жидкость центрифугируют еще 4 ч при 37 ООО об/мин в роторе № 40, Из осевщих рибосом выделяют 23 5, 165 и 5 РНК, а из надосадочной жидкости - тРНК, [c.227]

Выбор способа отделения бактериальных клеток от среды культивирования определяется тем, как в дальнейшем будут использоваться фракции. Так, если собираются изучать клетки, то их отделение путем фильтрования нежелательно, поскольку при этом клетки могут загрязниться материалом, имеющимся в фильтре. Если же будут исследовать культуральную жидкость, то после центрифугирования культуры рекомендуется отбрасывать часть надосадочной жидкости, чтобы избежать ресуспендирования клеточного осадка при ее удалении. [c.426]

Перед окончанием роста культуры отбирают 5 мл пробы (или больше) и добавляют к 5 мл смеси немеченых соединений, содержащей достаточное количество H2SO4, так чтобы конечный pH был равен 1,5—1,8. При этом происходит остановка реакции и перевод всех присутствующих в среде метаболитов в кислотную форму. Смесь немеченых соединений (при использовании Е. oli) содержит следующие компоненты, растворенные в основной ростовой среде этанол, уксусную кислоту, пиро-виноградную кислоту, муравьиную кислоту, фумаровую кислоту, молочную кислоту, янтарную кислоту и лимонную кислоту. Ввиду малых количеств конечных продуктов в 5—10 мл культуральной среды использование смеси немеченых соединений существенно для получения количественного выхода радиоактивных конечных продуктов, образуемых клетками. Концентрация каждого компонента смеси равна 0,1 М, за исключением фумаровой кислоты, концентрация которой составляет 0,05 М. Смесь немеченых соединений вместе с культурой центрифугируют для удаления клеток. Надосадочную жидкость отделяют и хранят до анализа в замороженном состоянии. При исследовании разных организмов требуется приготовление смесей различных немеченых соединений. Их состав, естественно, зависит от природы ко- [c.433]

Центрифугируют 24-ч культуру, выращенную в 10 мл бульона Тодда — Хевитта (разд. 20.3.33), и надосадочную жидкость переносят в колбу с дезинфицирующим веществом. Клетки суспендируют в 0,5 мл 0,067 М фосфатного буфера, pH 7,0 (разд. 20.4.16). Добавляют 0,5 мл 10%-ного дезоксихолата натрия и инкубируют при 37 °С в течение 15—30 мин. Положительная реакция суспензия становится прозрачной. Примеры положительный результат — Strepto o us pneumoniae-, отрицательный — другие а-гемолитические стрептококки. [c.15]

Культуру выращивают в 40 мл бульона Тодда — Хьюитта (разд. 20.3.33) в пластмассовых (поликарбо-натных или полипропиленовых) центрифужных пробирках объемом 50 мл с завинчивающимися крышками. После инкубации при 37 °С в течение 18—24 ч культуру центрифугируют в бакет-роторе при максимальной скорости. Надосадочную жидкость осторожно сливают в колбу Эрленмейера с дезинфицирующим раствором и протирают крышку центрифужной пробирки полотенцем, смоченным дезинфицирующим раствором. Следует убедиться в том, что вся надосадочная жидкость слита и взмучивания осадка во время сливания не было. К осадку добавляют 0,5 мл физиологического раствора (0,85% Na l) и суспендируют его, осторожно покачивая пробирку из стороны в сторону. Плотно завинчивают крышку и автоклавируют 15 мин при 121 °С. Снова центрифугируют при максимальной скорости, чтобы осадить автоклавированные клетки. Стараясь не взболтать осажденные клетки, переносят большую часть надосадочной жидкости с помощью пастеровской пипетки в маленькую пробирку. Жидкость должна быть совершенно прозрачной если она мутная, ее снова центрифугируют. В надосадочной жидкости содержатся растворимые антигены, экстрагированные из клеточных стенок стрептококков. [c.65]

В 50-е гг. Вернет, Ерне, Ледерберг и Тол1мейдж постулировали, что каждый В-лимфоцит запрограммирован на синтез антител одной определенной специфичности, относящихся к тому же идиотипу, что и молекулы, экспрессированные на поверхности данного лимфоцита в качестве антигенных рецепторов. В настоящее время это положение убедительно доказано. Если животное иммунизируют каким-либо антигеном, то начинается клональная экспансия и дифференцировка тех В-лимфоцитов, которые распознают этот антиген. В результате образуются плазматические клетки, которые продуцируют антитела. Если бы индивидуальные антиген-реактивные клетки лимфоидной ткани иммунизированного животного удалось длительное время поддерживать в культуре, то надосадочная жидкость содержала бы однородные молекулы антител (моноклональные антитела), которые были бы способны распознавать только один или несколько близкородственных антигенов. К сожалению, потомство индивидуального реактивного лимфоцита не удается длительное время выращивать в культуре для получения больших количеств моноклональных антител (МКА). Впервые эта проблема была решена Келером и Мильштейном в 1975 г. [1]- Исследователям удалось трансформировать антителообразующие лимфоциты путем слияния их с клетками иммортализованной клеточной линии с последующим клонированием индивидуальных гибридных клеток. Таким образом были получены линии гибридных клеток (гибридомы), каждая из которых продуцировала молекулы антител одного и того же идиотипа. [c.116]

Рис. 3. Анализ иммуноглобулинов, секретируемых клетками гибридомы. Условия биосинтетического включения метки в секретяруемые белки те же, чт указаны в подписи к рлс. 2. По 1 мл надосадочной жидкости из каждой культуры инкубировали 30 мин с белком Л, фикс1фоваиным на сефарозе (50 мкл осевших граиул геля), при комнатной температуре, непрерывно перемешивая, После 4-кратиого промывания геля ЗФР специфически сорбированные иммуноглобулины элюировали ДСН-буферным раствором для образцов. Т и Л — тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов i и u —соответственно окрашенные электрофореграммы и радиоавтографы одних и тех же гелей,

Рис. 4, Анализ иммулоглобулииов, секретируемых клетками гибрид( мы. Условия биосинтетического включения метки в секретнруемые белки же, что указаны в подписи к рис. 2, По 1 мл надосадочной жидкости от каждой культуры инкубировали с 20 мкл кроличьей антисыворотки к иммуноглобулинам мыши (4 С, 2 ч). Затем добавляли примерно 50 мкл осевших гранул геля сефарозы, нагруженных белком А, и инкубировали еще 15 мин, непрерывно перемешивая. Специфически сорбированные иммуноглобулины исследовали методом ДСН-ПАГЭ, как описано в тексте. Т и Л — тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов I и 1 — соответственно окрашенные электрофоре граммы и радиоавтографы одних и тех же гелей.

Для клонирования с помощью лимитирующих разведений 33 клетки из колонии на мягком агаре вносят в 10 мл среды и затем разливают в лункн панели для микротитроваиия с QS плоскодонными лунками (№ 3396, ostar). В каждую лунку предварительно помещают облученные (3300 Р) клетки-стимуляторы (ЫОв) и 100 мкл 10% Ной надосадочной жидкости из культуры, стимулированной Кон-А. Культивирование проводят, как описано выше, и за ростом культуры следят с помощью-микроскопа. Нет необходимости в добавлении свежей среды. [c.310]

Иммуноферментный метод представляет собой безопасный надежный и удобный метод определения моноклональных антител. Его можно использовать для изучения антител, содержащихся в надосадочной жидкости клеточных культур или в асцнтной жидкости мышей, инокулированных клетками гибридом. С помощью этого метода можно исследовать растворимые антигены, адсорбированные на поверхности пластика, и клетки, иммобилизованные в виде монослоев (при изучении их поверхностных антигенов). [c.337]

После того как выяснены условия воспроизводимого примирования, можно приступать к получению фактора. Суспензию селезенки, содержащую обученные Т-клетки, готовят в минимальной среде Игла с глутамином без отмывания. Если же Т-клетки необходимо отмыть или разделить на найлоновой вате, то в среду добавляют сыворотку плода коровы (10%). Взвесь клеток (Т, G)-A-L доводят до концентрации Ю мл и добавляют антиген. Оптимальную концентрацию антигена необходимо подобрать экспериментальным путем для (Т, G)-A-L она составляет 1 мкг/мл, для БЭ — 0,1 мл 0,1%-ной суспензии на 1 мл культуры. Чашки Петри, содержащие 2—3 мл суспензии, инкубируют 8 ч в атмосфере из 5% СОг и 95% воздуха при 37°С. Оптимальную продолжительность культивирования также подбирают эмпирически. Жизнеспособность обученных Т-клеток рекомендуется оценивать в начале и в конце культивирования с помощью трипанового синего. За это время должно погибать не более 20— 30% клеток. Если жизнеспособность клеток удовлетворительная, то клетки удаляют центрифугированием и надосадочную жидкость используют в качестве источника фактора Т-клеток. [c.330]

Клетки суспензионных культур после окончания действия цитостатика вместе с питательной средой сразу переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 6 мин при 1000 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочную жидкость удаляют, оставляя 0.5 мл для ресуспензирования осадка с помощью механического потряхивания. [c.80]

Смотреть страницы где упоминается термин Надосадочная жидкость из культур клеток: [c.260] [c.260] [c.311] [c.24] [c.251] [c.312] [c.259] [c.259] [c.547] [c.184] [c.173] [c.415] [c.17] [c.46] [c.48] [c.253] [c.254] [c.297] [c.312] [c.321] [c.324] [c.329] [c.335] [c.260] [c.138] [c.350]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология