Концентрация ферментного конъюгата

Концентрация ферментного конъюгата [c.179]

Принцип работы одного из типов анализатора заключается в следующем. Определяемые и меченные ферментом (каталазой или глюкозооксидазой) антигены конкурируют за центры связывания антител, иммобилизованных на мембране, окружающей кислородный электрод Кларка. После проведения иммунохимической реакции отмывают несвязавшиеся на мембране компоненты исследуемой смеси и вводят растворы субстратов фермента. Измеряемый ток на электроде пропорционален концентрации кислорода, поглощаемого (или выделяемого) в ферментативной реакции, осуществляемой связанным с антителами ферментным конъюгатом. Процедура регистрации иммобилизованных антител Позволяет использовать устройство многократно. Время анализа белковых антигенов (альбумин, инсулин) составляет 15 мин при чувствительности 5— [c.111]

Следует обратить внимание читателей на те основные тенденции развития иммуноферментного анализа, которые прослеживаются в представленной книге сокращение времени анализа и упрощение методик благодаря переходу к гомогенным методам анализа применение двойных меток (два фермента, фермент и якорная группа и т. д.), которые повышают специфичность детектирования ферментной метки использование моноклональных антител и множественный антигенный анализ для повышения специфичности иммунохимической стадии детектирования. Принципиально новым является создание методов иммунохроматографии, в которых концентрация вещества определяется не по активности ферментного конъюгата, а по его хроматографической подвижности. [c.6]

Иная ситуация возникает, когда в ИФА применяют меченную ферментом глобулиновую или IgG-фракцию, содержание антител в которых точно неизвестно и может варьировать в довольно широких пределах. Как правило, более 80% меченых IgG в таких конъюгатах неспецифичны к определяемому антигену. В этих случаях возможна детекция только тех меченых молекул антител, которые в ходе анализа образовали специфический комплекс с антигеном на твердой фазе. На ординату калибровочного графика при этом наносят регистрируемый параметр, пропорциональной концентрации ферментной метки на носителе (например, о. е., о. е./мин и т. д.). [c.260]

Большинству иммунологических методов анализа, которые, как правило, являются гетерофазными методами, присущи ограничения, связанные с диффузией. Антиген должен достичь иммобилизованных на твердой фазе антител и вместе с тем связаться с ферментным конъюгатом. При этом антиген и конъюгат должны мигрировать через реакционную среду. При наличии большого избытка антител, иммобилизованных на носителе, адсорбция антигена даже из растворов с очень низкой концентрацией будет проходить весьма эффективно. В роли фактора, направляющего процесс, в этом случае выступает высокая концентрация иммобилизованных антител. Реакции в жидкой фазе также определяются концентрацией антител. В то же время присутствие реагентов в высокой концентрации сводит к минимуму проблемы, связанные с диффузией. Ввиду высокой концентрации антител фактически отпадает необходимость в миграции молекул на значительные расстояния. Благодаря этим эффектам анализ обладает высокой чувствительностью и проводится очень быстро. [c.387]

Рабочие титры антител определяют в реакции ИФА методом шахматного титрования с использованием сэндвич -метода ИФА. Суть метода заключается в использовании подложки , т. е. слоя неспецифически сорбированных иммуноглобулинов, с которыми затем взаимодействует специфический антиген. Этот антиген в дальнейшем выявляется с помощью конъюгатов антител с ферментной меткой. Схема сэндвич -метода представлена на рис. 38. 96-луночный микропланшет заполняют раствором антител в концентрации 10 мкг/мл по 100 мкл в лунку и оставляют на ночь при 4 С. На следующий день после 3-кратного отмывания фосфатным буфером с твином-20 (с. 321) титруют положительный антиген по короткому ряду микропланшета, так же титруют отрицательный антиген . После инкубации в течение 1 ч при 37° С и последующего 3-кратного отмывания в таких же условиях титруют конъюгат антител в буфере по длинному ряду микропланшета. [c.319]

Рис. 10-17. Влияние соотношения гаптен/фермент и концентрации конъюгата на аналитический сигнал. А. Для анализов использовали по 20 мкл калибровочных образцов сыворотки, содержащих теофиллин. Ферментный реагент содержал конъюгат теофиллина с пероксидазой хрена 0,1 (кружки), 0,2 (треугольники) или 0,4 (квадраты) мкг/мл (5,4 молекул гаптена на молекулу фермента). Анализы выполняли, как описано в разделе Материалы и методы . Б. То же самое, что А, но ферментный реагент содержал конъюгаты (0,2 мкг/мл) разного состава 5,9 (кружки), 8,0 (ромбы), 11,8 (треугольники) или 14,0 (квадраты) молекул гаптена на молекулу фермента. Публикуется с разрешения издательства (Zuk et al., 1985).

Другой путь проведения ИФА в проточных реакторах основан на регистрации теплового эффекта реакции фермент — субстрат с помощью термистера. Определяемый экспериментально тепловой эффект зависит от количества связанного с иммуносорбентом ферментного конъюгата, которое в свою очередь зависит от начальной концентрации исследуемого соединения. На примере человеческого сывороточного альбумина с использованием его конъюгата с ката-лазой показана возможность определения белка в концентрации 0,1 мМ в течение 10 мин. [c.110]

В иммуноанализе с помощью Г6ФДГ также используют производные лекарственного вещества, связанные с ферментом. Присоединение антител против лекарственного вещества ингибирует активность конъюгата [лекарственное вещество — фермент] вследствие изменения конформации фермента. Как и в анализе с помощью лизоцима, лекарственное вещество из образца и ферментный конъюгат конкурируют за антитела к лекарственному веществу, причем остаточная ферментативная активность прямо пропорциональна концентрации лекарственного вещества в образце (рис. 3-1, А—Г). Ферментативную активность удобно измерять по образованию NADH, сильно поглощающего при 340 нм (Rowley et al., 1976). [c.39]

Эти структуры настолько близки, что в анализе нетилмицина можно использовать антисыворотку против конъюгата производного гентамицина с белком-носителем и ферментный конъюгат либо нетилмицина (непарная система), либо гентамицина (парная система). Различие между сигналами стандартных растворов нетилмицина с концентрациями 1 и 7 мкг/мл больше в случае непарной системы (200 условных единиц против 125 для парной системы). [c.45]

При использовании антисыворотки к гентамицину чувствительность измерения сисомицина в концентрации 4— 8 мкг/мл примерно на 30% выше, чем при измерении нетилмицина. Возможно, это вызвано тем, что иммуноген гентамицина больше похож по своему строению на сисомицин, чем на нетилмицин. По-видимому, структурное сходство способствует более успешной конкуренции лекарства с ферментным конъюгатом за антитела, а это приводит к увеличению чувствительности анализа. [c.45]

Методика анализа предусматривает смешивание образца с ферментным конъюгатом, погружение индикаторной полоски полученную смесь, инкубацию в течение 5 мин при воздействии ультразвуком и проявление с помощью цветных реакций в тече- ние 10 мин (см. раздел Материалы и методы ). При первой инкубации антиген одновременно связывается с иммобилизован-ными антителами и с конъюгатом антител и фермента. Окраши< вание в результате проявления происходит по тому же механизму, что и в описанном выше анализе Тйорфия. Однако в отличие от этого конкурентного анализа интенсивность окраски в двухцентровом сэндвич-методе пропорциональна концентрации антигена. [c.145]

Для построения калибровочной кривой зависимости интенсивности окраски от концентрации ХГТЧ использовали объединенные образцы мочи мужчин с добавкой очищенного гормона (рис. 10-13). Нижний предел обнаружения равен 10 мМЕ/мл при больших концентрациях, превышающих 1000 мМЕ/мл, на кривой появляется серповидный загиб. Уменьшение сигнала при высоких концентрациях ХГТЧ связано с ограниченной емкостью подложки и большим молярным избытком антигена по отношению к ферментному конъюгату в реакционной смеси. Серпо- [c.147]

При осуществлении ферментативных иммунометрических вариантов анализа для определения небольших количеств тестируемого компонента используют высокие концентрации как первичных антител, так и конъюгатов [антитело — фермент]. Компоненты подобных систем анализа изображены на рис. 24-1. Иммобилизованные на носителе ( захватывающие ) антитела специфичны к определенному уникальному участку структуры антигена. Антитела, входящие в состав ферментного конъюгата, обладают специфичностью к другому участку поверхности молекулы антигена. Поскольку связывание с первыми антителами не препятствует взаимодействию со вторыми — все три компонента можно смешать и инкубировать одновременно. По окончании периода инкубации твердую фазу промывают для удаления избытка всех несвязавшихся компонентов. Количество связавшегося с носителем конъюгата прямо пропорционально количеству связанного антигена. [c.387]

Готовят растворы двух препаратов инсулина в концентрации 100 мкг/мл и раститровывают в микропланшете для ИФА в концентрациях от 10 мкг до 5-10-5 мкг в лунку. Инкубируют в течение ночи при 4°С, тщательно отмывают. В лунки вносят раствор антител к свиному инсулину в концентрации 10 мкг/мл по 100 мкл. Инкубируют в течение часа при 37 °С, тщательно отмывают. Вносят конъюгат антимышиных антител с ферментной меткой и инкубируют в течение часа при 37 °С. Тщательно отмывают и вносят соответствующий субстрат (с. 319). Через 30 мин определяют величину оптической плотности при соответствующей длине волны (с. 320). Строят графики зависимости величины оптической плотности от разведения антигена. Полученные графики должны свидетельствовать о том, что специфичность связывания антител к свиному инсулину значительно выше по сравнению со связыванием бычьего инсулина, хотя в последнем случае и наблюдается специфическое связывание. Такой результат свидетельствует [c.327]

Существуют различные варианты иммуноанализа на основе ферментных каналов , но все они основаны на том, что в результате иммунологического связывания один из участников сопряженной пары (как правило, второй фермейт) попадает в микросреду, содержащую комплементарный фермент. Катализ эффективен только в том случае, когда молекулы двух ферментов находятся в близком контакте. Несвязавшийся конъюгат, содержащий второй фермент, вносит пренебрежимо малый вклад в аналитический сигнал, так как концентрация промежуточного продукта в растворе очень низка. Следовательно, нет необходимости в разделении связанных и свободных компонентов реакционной смеси. Особенности детектирования с помощью сопряженных ферментативных реакций обсуждены в обзоре Ал-мана и др. (Ullman et al., 1983), а применение метода для определения белков рассмотрено в данной книге (гл. 8). [c.132]

Ферментативный иммунохроматографический метод. Добавляют 10—20 мкг образца (буферного раствора, сыворотки или цельной крови) к 1 мл ферментного реагента (приготовленного на 0,1 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0 и содержащего 0,2 моль хлорида натрия 0,2—1,0 мг конъюгата [теофиллин — пероксидаза] 100 мг глюкозооксидазы 2 г неиммунных IgG барана). В полученную смесь погружают край индикаторной полоски (4x90 мм), содержащей иммобилизованные антитела против теофиллина ( 30 мкг/см ),и дают растворителю подняться за счет капиллярных сил до противоположного края полоски (на это уходит 10 мин). Переносят полоску в проявитель (приготовленный на 0,01 М натрий-фосфатном буфере, pH 7,0, и содержащий в 1 л 0,02 моль хлорида натрия 0,5 г тритона QS-44 400 мг 4-хлорнафтола 0,05 моль глюкозы 2 г бычьего сывороточного альбумина). Через 5 мин на бумаге появляется голубая окрашенная область в форме ровной полосы или ракеты. Высота окрашенной области пропорциональна концентрации определяемого вещества. Для количественного анализа предварительно строят калибровочную кривую, отражающую зависимость высоты окрашенного фронта от концентрации теофиллина. [c.135]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология