Олигонуклеотид-направленный

ДНК-полимераза I состоит из одного полипептида длиной 911 аминокислотных остатков (а. а.) (Air=102 000 D). Этот фермент отличается от прочих ДНК-полимераз Е. соИ наличием З -экзонуклеазной активности. Фактически ДНК-полимераза I — это два фермента на одной полипептидной цепи ограниченный протеолиз расщепляет эту ДНК-полимеразу на большой и малый фрагменты с разными активностями. Большой субфрагмент ДНК-полимеразы I (называемый также ДНК-полимеразой Кленова или фрагментом Кленова) обладает полимеризующей и З -экзонуклеазной (корректирующей) активностями. Малый субфрагмент несет З -экзонуклеазную активность, 5 -экзонуклеаза ДНК-полимеразы I действует на 5 -конец полинуклеотидной цепи только в составе дуплекса и отщепляет от него как моно-, так и олигонуклеотиды. Направление действия 5 -экзонуклеазы совпадает с направлением полимеризации новой цепи ДНК, т. е. в ходе полимеризации экзонуклеаза расчищает дорогу для полимеразы (рис. 29). Подобные свойства ДНК-полимеразы I соответствуют ее функциям в клетке эта полимераза удаляет различного рода дефекты из ДНК в ходе репарации и служит вспомогательной поли- [c.48]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ДНК фага М13 [c.159]

Термостабильность белковых молекул можно повысить, внеся в них изменения, благодаря которым они дольше не разворачиваются при повышении температуры. Кроме того, такие термостабильные белки часто не разрушаются в органических растворителях и при нефизиологических условиях (например, при экстремальных pH). К значительному повышению стабильности белковой молекулы может привести образование в ней дополнительных дисульфидных связей. Основная проблема здесь заключается в том, чтобы эти связи не мешали нормальному функционированию белка. В одном из экспериментов при помощи олигонуклеотид-направленного мутагенеза были созданы шесть вариантов лизоцима фага Т4 с новыми внутри-цепочечными дисульфидными связями. Для этого два, четыре или шесть специфических аминокислотных остатков в полинуклеотидной цепи были заменены на остатки цистеина, в результате чего образовалась одна, две и три дисульфидных связи соответственно (табл. 8.2). [c.168]

Каковы преимущества и недостатки олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием бактериофага М13 и ПЦР [c.177]

Рис. 6.11. Схема введения олигонуклеотид-направленных мутаций при использовании в качестве матрицы для полимеразной реакции одноцепочечной кольцевой ДНК

Недостатком классического варианта олигонуклеотид-направленного мутагенеза ДНК фага М13 являлось то, что выход гибридов обычно не превышал 5 %. Поэтому требовалось подобрать условия, которые позволили бы приблизиться к уровню 50 %, а может быть, и превысить его. [c.183]

Таблица 6.1. Выход (%) олигонуклеотид-направленных мутантов фага М13 в зависимости от генотипа

Рис. 6.14. Принцип эффективного введения олигонуклеотид-направленных мутаций в изучаемый клонированный ген.

ПОЛУЧЕНИЕ НОВЫХ ФОРМ БЕЛКОВ ОЛИГОНУКЛЕОТИД-НАПРАВЛЕННЫМ МУТАГЕНЕЗОМ [c.187]

Таким образом, методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза можно создавать ферменты, имеющие повышенную термостабильность или/и устойчивость к окислительной инактивации, а также повышенную удельную активность. Придание таких свойств фермен- [c.189]

Рис. 8.1. Олигонуклеотид-направленный мутагенез. Одноцепочечную ДНК фага М13 (плюс-цепь), несущую ген-мишень, отжигают с комплементарным синтетическим олигонуклеотидом, содержащим одно основание, не комплементарное соответствующему основанию исходной ДНК. Олигонуклеотид служит затравкой для синтеза ДНК, а М13-вектор с встроенным геном — матрицей. Репликацию катализирует фрагмент Кленова ДНК-полимеразы 1 Е. oli. Синтезированную полноразмерную цепь замыкает в кольцо ДНК-лигаза Т4. Образовавшимися двухцепочечными молекулами трансформируют Е. соИ. Часть фаговых частиц содержит ДНК дикого типа, часть — мутантную ДНК.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК Основной недостаток олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза с использованием фага М13 -большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага М13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК. Это позволяет обойтись без переноса Интересующего исследователя гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагенеза - обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину в середине последнего заменен один нуклеотид (рис. 8.3). Клетки Е. соИ трансформируют вектором, несущим ДНК-мишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеоти- [c.161]

Рис. 8.3. Олигонуклеотид-направлен-ный мутагенез с использованием плазмидной ДНК. Ген-мишень встраивают в полилинкер вектора pALTER. Плазмидную ДНК денатурируют в щелочи и отжигают с тремя олигонуклеотидами мутагенным олигонуклеотидом, олигонуклеотидом, восстанавливающим устойчивость к ампициллину (Amp ), и олигонуклеотидом, придающим чувствительность к тетрациклину (Tef ). Эти олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК с помощью ДНК-по-лимеразы Т4, а исходная цепь - матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются ДНК-лигазой Т4. Продуктами реакции трансформируют клетки Е. соН и отбирают трансформантов Amp и Tet.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевьгх молекул с [c.163]

Рис. 8.4. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР. Реакцию проводят в двух пробирках, в каждой из которых содержится одинаковая двухцепочечная плазмидная ДНК, но разные наборы праймеров. Праймеры 1 и 3 содержат один неспаривающийся нуклеотид и комплементарны разным цепям плазмидной ДНК. Праймеры 2 и 4 полностью комплементарны соответствующим участкам плазмидной ДНК и тоже гибридизуются с разными цепями. Положение сайтов гибридизации для праймеров каждой пары различается, но их концы стыкуются. В результате ПЦР-амплификации образуются линейные молекулы. По окончании реакции содержимое пробирок смещивают и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. В результате кроме двух исходных линейных амплифицированных молекул образуются две кольцевые плазмидные ДНК, каждая с двумя одноцепочечными разрывами. После трансформации кольцевыми молекулами клеток Е. соН разрывы репарируются ферментами клетки-хозяина, и плазмида может реплицироваться независимо. Линейные молекулы ДНК в Е. oli не сохраняются.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием векторов на основе фага М13 эффективный универсальный метод внесения точковых мутапий в любой фрагмент ДНК [c.165]

Изменение специфичности фермента Олигонуклеотид-направленный мутагенез используют в основном для улучшения уже суше-ствуюших свойств ферментов, но, вероятно, с его помошью можно изменять ферменты таким образом, чтобы они преобретали другую специфичность. Например, таким способом на основе относительно неспецифичной эндонуклеазы Еок были получены новые сайтспецифичные эндонуклеазы. [c.173]

Опищите стратегию олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием плазмидной ДНК. [c.177]

Рис. 10.2. Схематическое изображение нативной и модифицированной форм гормона роста человека (ГРЧ). С помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза получена форма ГРЧ, утратившая способность связываться с пролактиновым рецептором, но сохранившая специфичность к рецептору гормона роста.

Данный метод предполагает, что за антигенсвязываюшую способность антитела отвечают только DR-участки, а не каркасные области. Однако, если связывание гибридного антитела с антигеном происходит недостаточно эффективно, может возникнуть необходимость в замене некоторых аминокислот в каркасных областях с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза. [c.217]

Как видим, сегмент-направленный статистический (случайный) мутагенез можно осуществлять альтернативными методами. Получающийся при этом широкий спектр мутантов позволяет проводить исследование структурно-функциональной организации изучаемого локуса. Недостатки данного подхода состоят в том, что с его помощью сложно получить мутант со строго определенными заменами нуклеотидов и нельзя ввести в ДНК заранее запланированные делеции и вставки. Эти возможности обеспечивает олигонуклеотид-направленный (сайтспецифический) мутагенез- [c.180]

Разработанный на модельной системе фага 0X174 метод олигонуклеотид-направленного мутагенеза получил дальнейшее развитие на других типах молекул ДНК, прежде всего на ДНК нитевидных фагов и плазмидах. У плазмид приходится получать одноцепочечные кольцевые формы при определенных ферментных обработках двухцепочечной ДНК in vitro, что обычно осуществить не очень просто. Поэтому наиболее широко используют нитевидные фаги, и в первую очередь фаг М13. На кольцевой одноцепочечной ДНК фага М13 удобно достраивать вторую цепь. Кроме того, создана серия векторных молекул на основе ДНК фага М13, и данный фаг с успехом используется при секвенировании клонированных последовательностей ДНК методом Сэнгера. [c.183]

Пионерские работы по олигонуклеотид-на-правленному мутагенезу фага М13 и гибридов на его основе провели Дж. Мессинг с сотрудниками (1981-1983 гг.). Они продемонстрировали возможность вводить в геном фага с помощью олигонуклеотидов направленные замены, вставки, делеции (рис. 6.11). Таким путем, в частности, получены новые векторные производные серии Ml Зтр (рис. 6.12). Важной особенностью данного метода является то, что олигонуклеотид-мутаген может быть использован для эффективного отбора получаемых мутантных клонов. С этой целью выросшие после трансфекции клоны ДНК гибридизуют на нитроцеллюлозе с З2р меченным синтетическим олигонуклеотидом-мутагеном при низкой температуре, а затем осуществляют последовательные отмывки радиоактивного зонда при повы- [c.183]

Благодаря разработке и совершенствованию методов клонирования и идентификации генов, секвенирования последовательностей ДНК, химического синтеза олигонуклеотидов, направленного мутагенеза молекул ДНК in vitro и оптимизации экспрессии целевых генов в клетках Е. соИ появилась возможность создавать мутантные формы генов и нарабатывать в достаточных для анализа количествах соответствующие им измененные варианты изучаемых белков. В целом направление исследований по конструированию методами генетической инженерии белков с измененными по отношению к природному прототипу свойствами, химерных белков, обладающих свойствами двух или более отдельных белков, и т. п., т. е. создание неприродных вариантов бежов и изучение их свойств, получило название белковая инженерия . [c.187]

His48 и остатком рибозы. Путем олигонуклеотид-направленного мутагенеза с1члистстнук -щие триплеты заменяли, а мутантные гены экспрессировали в Е. соИ. Каждую мутантную форму TyrTS выделяли из клеток Е. соИ и анализировали ее ферментативную активность. [c.187]

В целях расширения возможностей создания нового поколения живых вакцин К. Барк с соавторами сконстр)Т1ровали плазмиду p ASl, названную кассетным вектором. В составе плазмиды p ASl, содержащей полную ДНК-копию генома полиовируса под контролем промотора фага Т7, олигонуклеотид-направленным мутагенезом в область, кодирующую АД1, введены участки гидролиза рестриктазами San и Dra (рис. 17.1). Сегмент ДНК, ог- [c.437]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология