Плазмида гены устойчивости к антибиотикам

Дальнейший успех генной инженерии был связан с обнаружением плазмидов. В 1952 г, Дж. Ледерберг нашел, что в кишечной палочке, кроме основной ДНК, которая не переходит из одной клетки в другую, имеются еще маленькие молекулы ДНК — плазмиды, которыми бактериальные клетки охотно обмениваются. В 1959 г. в Японии обнаружили, что плазмиды содержат гены устойчивости к разным антибиотикам и именно они ответственны за быстрое привыкание бактерий к внешним ядам . [c.562]

Рис. 25.8. Плазмидный вектор, содержащий ген устойчивости к антибиотику ампициллину. Благодаря присутствию такого гена мы имеем возможность на среде с ампициллином отбирать клетки, несущие плазмиду. Клетки, не содержащие плазмиду, на такой среде погибают.

Какова функциональная роль плазмид и мобильных элементов бактерий Ниже будет рассмотрена существенная роль этих структур в эволюции бактерий, но эволюционные, т. е. отдаленные, преимущества вряд ли могут объяснить поддержание в бактериальных клетках мобильных элементов и плазмид в тех случаях, когда они не приносят непосредственных селективных выгод. Так, например, если считать, что в клетке поддерживается только функционально необходимый генетический материал, непонятно, почему плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотикам, встречаются не только в клинике, где эти антибиотики применяют, но и в других местах обитания, лишенных подобного селективного давления. Совсем непонятно, почему существуют плазмиды, вообще не приносящие никаких непосредственных преимуществ содержащим их клеткам, и IS-элементы. [c.122]

Рестрикция ферментом, расщепляющим плазмиду на участке одного из генов устойчивости к антибиотику [c.103]

О плазмидах заговорили, причем не столько молекулярные биологи, сколько медики, после того как в 1959 г. японские исследователи обнаружили, что неэффективность хорошо зарекомендовавших себя антибиотиков при лечении дизентерии у некоторых больных обусловлена тем, что бактерии, которыми заражены эти пациенты, несут в себе плазмиду, содержащую сразу несколько генов устойчивости к разным антибиотикам. [c.60]

Плазмиду, несущую искусственный ген, добавляют к бактериальным клеткам. Чтобы отобрать только те бактерии, которые несут нужную плазмиду, поступают следующим образом. Наряду с нужным геном в плазмиду включают ген устойчивости к какому-либо антибиотику или даже целый тандем генов, обеспечивающий устойчивость сразу к нескольким антибиотикам. Клетки растят на среде, содержащей эти антибиотики. Этот прием не только обеспечивает отбор нужных бактерий, но и не позволяет им избавляться от искусственных плазмид. Существуют также методы, позволяющие заставить каждую клетку содержать не одну-две, а тысячи копий плазмиды. Использование этих приемов позволяет добиться фантастической производительности по отношению к белку, закодированному во встроенном гене. Есть случаи, когда этот белок по массе составляет чуть ли не половину всего белка клетки. [c.63]

Транспозонами (Тп-элементами) называют сегменты ДНК, обладающие теми же свойствами, что и IS-эле.менты, но содержащие кроме того, гены, не и.меющие непосредственного отношения к транспозиции. Транспозоны могут нести гены устойчивости к антибиотикам, гены токсинов или гены дополнительных фер.ментов клеточного метаболизма. В общем, для транспозонов характерны те же гены, которые встречают в плазмидах. Более того, нередко присутствие в составе плазмиды того или иного гена обусловлено наличием в последовательности плазмидной ДНК соответствующего транспо-зона (см. раздел 3 этой главы). Транспозон может быть устроен так же, как IS-элемент, но с дополнительным геном. Однако важно отметить, что часто два IS-элемента, оказавшиеся поблизости друг от друга, способны перемещаться вместе, одновременно перенося заключенный между ними сегмент ДНК- Таким образом, два расположенных рядом lS-эле.мента могут образовать транспозон. Транс- [c.113]

Успехи в исследовании генетической организации бактерий усугубили конфликт. Бактерии, посредством плазмид, довольно охотно обмениваются уже имеющимися генами. Это придает им способность быстро меняться. Взять, например, гены устойчивости к антибиотикам. Эти гены вовсе не возникают вновь и вновь у каждой бактерии, которая привыкает к данному антибиотику, как думали когда-то, а попадают к ней в готовом виде извне вместе с плазмидой. По-видимому, вообще источником этих генов, в конечном счете, являются сами продуценты антибиотиков, которые с самого начала должны были их иметь, чтобы защищать себя от своих же ядов. [c.77]

Плазмиды. У значительного количества микроорганизмов обнаружены плазмиды вдобавок к основной хромосоме (рис. 17). Это кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, которые могут существовать и реплицироваться как независимо от бактериальной хромосомы, так и быть интегрированными в нее. Плазмиды не являются обязательным для клетки элементом, хотя могут давать определенные преимущества. Известно, что плазмиды могут нести гены устойчивости к антибиотикам, тяжелым металлам, различ- [c.28]

К счастью, правильно спланировав эксперимент, можно минимизировать влияние метаболической перегрузки, оптимизировать выход рекомбинантного белка и повысить стабильность трансформированных хозяйских клеток. Например, нагрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмидные векторы. А еще лучше вообще отказаться от векторов и встроить чужеродную ДНК в хромосомную ДНК организма-хозяина. В этом случае не нужно заботиться об обеспечении стабильности плазмиды. Кроме того, клетке не приходится расходовать свои ресурсы на синтез ненужных продуктов, кодируемых маркерными генами устойчивости к антибиотикам. Синтез продуктов таких генов, входящих в состав плазмидных векторов наряду с генами-мишенями, является одной из основных причин метаболической перегрузки. Интеграция в хромосому особенно важна в тех случаях, когда используется сам рекомбинантный микроорганизм, а не синтезируемый им продукт. Уменьшению метаболической перегрузки помогает также применение сильных, но регулируемых промоторов. В таких случаях ферментацию проводят в две стадии. На первой из них, во время роста, промотор, контролирующий транскрипцию гена-мишени, выключен, а на второй, во время индукции, -включен. [c.128]

Плазмиды несут ген устойчивости к определенному антибиотику. Если в питательную среду, на которой выращивают бактерии, добавить этот антибиотик, то размножаться и формировать колонии смогут только трансформированные клетки (те, которые содержат плазмиды). [c.224]

Использование бактериальных плазмид в качестве векторов для клонирования. Клетки бактерий содержат хромосомную ДНК. Однако помимо хромосом бактерии содержат большое число небольших (1—25 т. н. п.) кольцевых молекул ДНК. Такие кольцевые молекулы называют плазмидами. Некоторые плазмиды имеют в своем составе гены устойчивости к антибиотикам, представленные большим числом копий. Высокая копийность плазмид обеспечивает клетке синтез большого количества ферментов, биохимически нейтрализующих антибиотики, что и обеспечивает устойчивость бактериальной клетки к последним. [c.37]

Многие плазмиды несут гены, обусловливающие устойчивость к антибиотикам. Это оказывается полезным при создании клонирующих систем. Обычно используют плазмиду, несущую два гена, обеспечивающих устойчивость к разным антибиотикам. Один из них служит просто для идентификации бактерий, несущих плазмиду, путем отбора клеток, устойчивых к антибиотику. Другой служит для того, чтобы отличить гибридную плазмиду от родительского вектора. Если сайт встраивания чужеродной ДНК находится внутри такого гена, гибридная плазмида теряет устойчивость к антибиотику. Таким образом, селекция родительского вектора может производиться по признаку устойчивости к двум антибиотикам, в то время как отбор гибридной плазмиды может основываться на сохранении устойчивости к одному антибиотику и чувствительности-к другому. [c.237]

Отбор бактерий-трансформантов можно продемонстрировать, используя плазмиду pBR322 (см. рис. 5.10), содержащую два гена устойчивости к тетрациклину и ампициллину. Для отбора этих бактерий в агар добавляют антибиотик — или ампициллин, или тетрациклин в зависимости от того, какой из генов (Ыа или tet) остался интактным после введения чужеродной ДНК. На такой среде клоны образуют клетки только с плазмидами. Для отделения рекомбинантных бактерий часть материала каждого клона переносят на другую чашку Петри, содержащую антибиотик, ген устойчивости к которому был разрушен при создании рекомбинантов. На этих чашках Петри дают клоны только те бактерии, которые содержат исходную плазмиду, а рекомбинантные бактерии их не образуют. Такая тщательная селекция клонов по устойчивости к антибиотику позволяет идентифицировать рекомбинантные клоны. При поиске рекомбинантных клонов успешно применяют метод авторадиографии. [c.121]

Например, можно отбирать бактериальные клетки, если они несут плазмиду с фактором устойчивости к антибиотику, выращивая их на среде, содержащей этот антибиотик. Нетрансформированные клетки без плазмид (и, следовательно, без гена устойчивости к антибиотику) просто не будут расти на такой среде. В последние годы разработано много специальных методов селекции, которые позволяют отби- [c.124]

Устойчивость к тяжелым металлам может быть конститутивным или индуцируемым признаком. У некоторых бактерий обнаруживаются высокоспецифические конститутивные механизмы устойчивости к солям тяжелых металлов. Гены, определяющие механизмы устойчивости, находятся иногда в хромосоме, но чаще в плазмидах, в 70% случаев они сцеплены с генами устойчивости к антибиотикам. [c.479]

Плазмиды, несущие гены устойчивости микроорганизмов к антибиотикам, обнаруживаются практически у всех групп патогенных бактерий. Поэтому частота резистентности к антибиотикам обусловлена, в первую очередь, распространением генов, детерминирующих устойчивость. Перенос генов устойчивости может происходить не только внутри клеток одного вида, но и у различных видов и родов микроорганизмов. [c.456]

Оказавшись в бактериальной клетке, линейная молекула pLFR-5 со вставкой замыкается в кольцо благодаря спариванию os-сайтов. В такой стабильной конфигурации она может долгое время существовать в клетке и реплицироваться как гибридная плазмида, поскольку содержит все необходимые для этого элементы. Более того, ген устойчивости к тетрациклину обеспечивает рост колоний, несущих данную космиду, на среде с этим антибиотиком нетрансформированные клетки при этом погибают. Существуют и другие космидные векторы на основе фага X. [c.76]

Вначале чужеродные гены вводили в ДНК хлоропластов в составе плазмидного вектора, несущего неселективную чужеродную ДНК и селективный маркер, например ген устойчивости к антибиотику, фланкированные специфическими последовательностями хлоропластной ДНК (рис. 17.7). Такая стратегия была весьма эффективной, однако нередко селективный маркер мешал экспрессии фланкирующих хлоропластных генов. Чтобы решить эту проблему, разработали стратегию, в которой селективный маркер и чужеродный ген не были физически связаны друг с другом. Для этого растения табака трансформировали смесью одинаковых количеств двух разных плазмид одна содержала селективный маркер (ген устойчивости к спектиномицину), фланкированный ДНК из одного участка хлоропластной ДНК, а вторая — чужеродный ген (ген устойчивости к канамицину), фланкированный последовательностями из другого участка [c.385]

Таким путем получают множество фрагментов исходной ДНК, встроенных в ДНК вектора (клонотеку). Далее рекомбинантными ДНК трансформируют клетки бактерии-хозяина (специальные штаммы E. oli, не содержащие других плазмид или фаговых ДНК). В разные клетки могут попадать разные фрагменты ДНК донора (или вообще не попадать). Поэтому клетки рассевают таким образом, чтобы потомство каждой из них (клон) получить отдельно. При использовании плазмид в качестве векторов отбирают только клоны, выживающие в присутствии антибиотика, ген устойчивости к которому не содержит сайта рестрикции использованной рес-триктазы. Это тест на присутствие плазмиды в клетке хозяина. [c.104]

Наиболее простым способом отбора трансформированных клеток является введение в плазмиду вместо онкогенов тДНК генов устойчивости к антибиотикам. Однако попытки введения в вектор генов устойчивости к антибиотикам оказались безуспешными, так как они не экспрессировались в растительных клетках. [c.505]

Проблема была решена, когда удалось найти промотор гена нопалин-син-тазы и ввести его в Т.-плазмиду. Регуляторные системы гена — нопалин синтазы — способствовали экспрессии генов устойчивости к антибиотикам, и отбор трансформированных клеток оказался возможным на селективных средах, содержащих антибиотики. [c.505]

Оказалось, что вообще гены устойчивости к антибиотикам, то есть те гены, из-за которых осложнилась в последние годы борьба с бактериальными инфекциями, всегда располагаются в плазмидах. Способность свободно переходить из одной бактерии в другую приводит к тому, что плазмиды, нееухцие такие гены, очень быстро распространяются среди бактерий, как только начинается широкое применение того или иного антибиотика. Стафилококковая инфекция, ставшая буквально бичом хирургических клиник, обязана своей дьявольской стойкостью тоже плазмидам. [c.60]

Обычный метод клонирования ДНК основан на расщеплении плазмидной и встраиваемой ДНК одной и той же рестрик-тазой. При этом получаются молекулы с липкими концами, которые затем отжигают, получают кольцевую рекомбинантнук> молекулу и сшивают ДНК-лигазой фага Т4. В случае плазмиды pBR322 встраивание обычно осуществляют по генам устойчивости к антибиотикам, поскольку такие рекомбинантные молекулы легко распознать по их неспособности обеспечить, устойчивость. [c.317]

Транспозоны-это последовательности ДНК, которые способны встраиваться во многие участки генома и могут перепрыгивать с плазмиды на бактериальную хромосому, на другую плазмиду или на умеренный фаг. Транспозоны содержат гены, определяюпще внешне распознаваемые признаки, а именно устойчивость к таким антибиотикам, как пенициллин, тетрациклин или канамицин. В связи с этим их легче обнаружить, чем IS-элементы. По обе стороны от генов устойчивости, находящихся внутри транспозона, расположены две одинаковые последовательности, которые могут идти в одном и том же или в противоположных направлениях. Эти повторяющиеся последовательности оснований ДНК частью идентичны с IS-элементами. Расположение этих фланкирующих отрезков ДНК можно определить путем электронномикроскопического исследования гетеродуплексов (рис. 15.13). [c.455]

Впервые плазмида в качестве вектора была использована в 1973 г. в лаборатории П. Берга. Эксперименты проводились с небольшой ( 9 т. и. п.) плазмидой Е. соИ pS lOl, несущей ген устойчивости к антибиотику тетрациклину. Она содержала только один сайт рестрикции для E oR I. Под [c.37]

Часто природные плазмиды обладают многими, но не всеми необходимыми свойствами клонирующего вектора. В целях создания лучших векторов из исходного природного материала было разработано несколько подходов. Эти подходы могут заключаться во внесении изменений в систему контроля репликации или в добавлении в плазмиду генов, определяющих устойчивость к специфическим антибиотикам. Один из стандартных клонирующих векторов, наиболее широко используемых в настоящее время, рВЮ22, был получен путем нескольких последовательных изменений ранее существующих клонирующих векторов. Это мультикопийная плазмида, несущая гены устойчивости к тетрациклину и ампициллину и имеющая в удобных участках сайты рестрикции для нескольких рестриктаз. [c.237]

Впервые транспозоны были обнаружены, когда оказалось, что некоторые гены устойчивости к антибиотикам связаны с инфекционными факторами устойчивости. Общая структура факторов устойчивости изображена на рис. 8.13, Б. При исследовании гетеродуплексной ДНК, образованной ДНК F-фактора, и фактора устойчивости обнаружена гомология по всей области tra-генов, что свидетельствует об эволюционном родстве этих структур. Последовательность ДНК, кодирующая устойчивость к тетрациклину, tet, обрамлена элементами IS 3 и встроена в область гомологии фактора устойчивости и F-фактора. В негомологичной области карты локализованы гены, кодирующие резистентность к ампициллину (атр), сульфонамиду (sul), стрептомицину (str), хлорамфе-николу (ст[) и канамицину (кап). Эти гены устойчивости порознь или группами обрамлены IS элементами или другими инвертированными повторами (указаны стрелками на рис. 8.13, Б). Отдельные гены устойчивости например, tet или атр, могут переноситься в другие эписомы или плазмиды, а также в хромосомы фагов и бактерий, почему и возник термин транспозон. [c.244]

Молекулярное клонирование [34, 39]. Ключевым методом явилось молекулярное клонирование фрагментов ДНК, или генная инженерия в узком смысле слова. Этот метод, впервые описанный П. Бергом в США, позволяет нарабатывать большие количества любого отрезка ДНК, встраивая его в ДНК бактериальной плазмиды или бактериофага и заражая такой рекомбинантной ДНК бактерию-хозяина. Чаще всего в плазмиду или фаг встраивают либо фрагменты эукариотической геномной ДНК, либо кДНК, полученную в результате обратной транскрипции мРНК. Когда работают с плазмидами, то обычно используют такие, которые несут ген устойчивости к какому-либо антибиотику В результате на среде с антибиотиком растут и дают колонии лишь те бактерии, в которые проникли рекомбинантные плазмиды. Когда работают с фагом, то следят за возникновением бляшек, т. е. очагов размножения фага, ведущего в лизису (разрушению) бактерий. Каждая колония или бляшка, полученная из одной исходной клетки, содержит один тип плазмиды [c.30]

Смотреть страницы где упоминается термин Плазмида гены устойчивости к антибиотикам: [c.257] [c.118] [c.57] [c.58] [c.117] [c.125] [c.145] [c.301] [c.304] [c.434] [c.440] [c.308] [c.308] [c.278] [c.328] [c.167] [c.168] [c.29] [c.74]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология