Концевые группы белков определение методом

Другой метод определения С-концевой аминокислоты основан на восстановлении концевой карбоксильной группы литийалюминийгидридом. Белок перед восстановлением полезно этерифицировать диазометаном. Полный гидролиз дает легко выделяемый и идентифицируемый амино-спирт, соответствующий С-концевому остатку аминокислоты. [c.369]

Для определения размеров полипептидных цепей белковой молекулы разработаны специальные химические методы. Эти методы основаны на использовании особого реагента (динитрофторбензола), который соединяется со свободной аминогруппой аминокислотного остатка на конце полипептидной цепи с образованием окрашенного комплекса этот комплекс можно выделить и идентифицировать после того, как белок подвергнется гидролизу и распадется на составляющие его аминокислоты (в том числе и на концевую аминокислоту с присоединенной к ней окрашенной группой). Так, было показано, что один из типов молекул гемоглобина, обнаруженный в красных кровяных тельцах большинства взрослых людей (называемый гемоглобином А), содержит четыре полипептидные [c.680]

В случае применения безводных органических растворителей, содержащих кислоту, возможна миграция ацильных групп, находящихся у определенных остатков оксиаминокислот. Так, при определении концевых групп по методу Эдмана (см. стр. 237—245), согласно которому производное пептида обрабатывают нитрометаном и НС1 [87], уксусной кислотой й НС1 [88] или диоксаном и НС1 [186] для циклизации Ы-Конце-вого остатка, установлено [2, 314], что на последующих стадиях отщепления обнаруживаются небольшие Количества Ы-концевь1Х остатков серина или треонина. В одном случае это привело к неправильному выводу о последовательности аминокислотных остатков [2, 186]. Обычно исследуемое соединение обрабатывают СвНаЫСЗ или динитрофторбензолом при pH 8,5. Если же белок находится в среде с такой величиной pH до добавления реагента, то свободные аминогруппы, появляющиеся в результате миграции ацильной группы от N к О, вновь образуют пептидные связи. Предварительную [c.222]

Сначала определяют концевые аминокислоты белка, особенно важно определить аминоконцевую (или N-кoнцeвyю) АК - это начало белковой молекулы. Важно также знать и число К-концевых групп, так как белок может содержать более одной полипептидной цепи. Для определения аминоконцевых АК используют следующие методы [c.24]

Карбоксипептидаза практически нерастворима в воде и в разведенных солевых растворах. Перед использованием суспензию фермента промывают 3 или 4 раза ледяной водой. При приготовлении раствора этого фермента для определения концевых групп можно рекомендовать следующий метод [3] смешивают около 0,25 мл водной суспензии фермента с 6 мл 2М раствора хлористого натрия и постепенно доводят pH раствора до 10,0, добавляя 0,01 н. К аОН из. микробюретки. Как только фермент растворится, добавляют 0,6 мл М буферного раствора фосфата натрия pH 8,0 при этом устанавливается значение pH около 8,3. Неактивный белок, который выпадает в осадок, если оставить раствор на 2 час при 4°, отделяют центрифугированием на холоду. Концентрацию выделенного фермента можно определить спектрофотометрически на основании следующих данных [c.187]

За последнее десятилетие были достигнуты значительные успехи в дальнейшем установлении точного строения различных белков. Хотя гидролиз белков и последующий анализ гидролизата, который широко использовался раньше, давал возможность получать данные об относительном содержании и природе входящих в состав белка аминокислот, он не позволял сделать какие-либо выводы о распределении аминокислот в полипептидной цепи молекулы белка. Методы анализа и разделения аминокислот до сороковых годов были очень длительными и трудоемкими н требовали сравнительно больших количеств исходного продукта. Разработанные в 40-х годах новые методы анализа и разделения аминокислот и определения концевых групп в молекулах белков и не слишком высокомолекулярных полипептидов создали возможность наметить основные направления решения исключительно важной проблемы выяснения специфической последовательности аминокислот в молекулах некоторых сравнительно простых белков. Первым большим достижением в этой области химии была расшифровка Сангера с сотр. [4] последовательности аминокислот в молекуле инсулина. С момента опубликования этой важнейшей работы, достигшей цели, которая в течение длительного времени казалась неосуществимой, была полностью выяснена последовательность аминокислот у нескольких белков. Установление того факта, что молекулы специфического белка являются однородными по молекулярному весу и содержат строго определенную последовательность аминокислотных звеньев, неизменную для всех макромолекул, явилось одним из наиболее важных достижений химии белка. В число белков, для которых была выяснена последовательность аминокислот, входят инсулин [4], цитохром С [5—7 , белок вируса табачной мозаики [8—10], рибонуклеаза [11 — 13], а- и Р-цепи гемоглобина человека [14, 15], миоглобин кита [16—18], кортикотропин [19—21], глюкагон [22] кроме того, была установлена последовательность аминокислот в некоторых полипептидах более низкого молекулярного веса и частично выяснена последовательность аминокислот у нескольких высокомолекулярных белков [23]. [c.329]

В результате ферментативного воздействия, определяли последовательно после каждого отщепления Ы-концевого остатка по методу Эдмана (см. гл. 6). При изучении гемоглобина (Брауницер был удачно применен последовательный гидролиз белка разными про-теолитическими ферментами. В этом случае на белок действовали трипсином, а затем полученные пептиды гидролизовали пепсином, специфичность которого значительно повышали, ограничивая время реакции. Методические трудности, связанные с фракционированием сложных гидролизатов и определением полной структурной формулы белка, были преодолены в результате упорного труда нескольких групп ученых. Мы теперь знаем полную аминокислотную последовательность инсулина, глюкагона, рибонуклеазы, гемоглобина, белка вируса табачной мозаики, а также кортикотропина и других пептидных гормонов приближаются к завершению работы по установлению строения папаина, лизоцима, химотрипсиногена, трипсииогена, цитохрома с успешно продвигается изучение некоторых других белков. Изучение последовательности аминокислот проводилось на частичных кислотных гидролизатах или на гидролизатах, полученных при действии различных протеолитических ферментов. Чисто химические методы избирательного расщепления пептидных цепей не имели до сих пор значительного успеха, и эта область остается еще нерешенной задачей пептидно химии. [c.117]