Плазмиды включение ДНК

Существуют и другие, более близкие опасности. В 1974 г. Комитет по рекомбинантным молекулам ДНК Национальной Академии наук США обратился с призывом о прекращении экспериментов в двух направлениях, которые могут представить опасность для человечества в целом [269]. В своем обращении комитет подчеркнул, что использование Е. соИ для клонирования рекомбинантных молекул может оказаться опасным, поскольку эти бактерии обитают в кишечнике человека и могут обмениваться генетической информацией с бактериями, патогенными для человека. Комитет считает, что следует добровольно отказаться от исследований в двух указанных им направлениях, которые могут привести к случайному включению в хромосому генов, обусловливающих устойчивость к антибиотикам и к образованию токсинов, а также к развитию опухолей. Особые предостережения были высказаны в отношении любых планов, направленных на сцепление фрагментов ДНК животных с ДНК бактериальных плазмид или фагов. Предполагается, что контроль за проведением такого рода исследований должен осуществляться различными организациями, субсидирующими биохимические исследования [269]. [c.296]

Как может встраиваться в плазмиду кусок чужеродной ДНК Почему включение ДНК эукариот в плазмиду имеет как биохимическое, так и этическое значение Какую важную биохимическую проблему, возможно, удастся решить в будущем при помощи этого метода [c.308]

При наличии в клетке плазмиды часть энергетических ресурсов расходуется на ее репликацию, транскрипцию и синтез белков, которые она кодирует. При этом, как правило, многокопийные плазмиды требуют больше энергии, чем мал око-пийные, и в результате часть клеток в процессе роста популяции утрачивает плазмиды. Клетки, лишившиеся своих плазмид, обычно растут быстрее тех, в которых они сохранились, и в конечном счете оказываются в культуре преобладающими. По прошествии нескольких генераций это отражается на количестве синтезируемого продукта клонированного гена. Разработано по крайней мере два подхода к решению этой проблемы. В лабораторных условиях для сохранения плазмид клетки выращивают в присутствии антибиотиков или метаболитов, обеспечивающих рост только тех клеток, в которых есть плазмида. Однако добавление антибиотиков и каких-то других веществ в культуры, выращиваемые в больших объемах, или в промышленные ферментеры приводит к значительному удорожанию конечного продукта. Особенно важно, чтобы клонированные гены сохранялись, не утрачиваясь и не передаваясь другим микроорганизмам, в том случае, когда сконструированный микроорганизм предназначен для использования вне стен лаборатории. Он должен не только оставаться эффективным, но и быть экологически безопасным. Включение клонированной ДНК в хромосомную ДНК хозяйского организма позволяет обойтись без плазмид и избежать утраты плазмидных генов. [c.123]

А. Ген встроен в середину клонированного в плазмиде сегмента аЬ, гомологичного сегменту а Ь в хромосомной ДНК. В результате двойного кроссинговера (Х-Х) клонированный ген оказывается в составе хромосомы. Б. Ген встроен вблизи клонированного в плазмиде сегмента с, гомологичного сегменту с в хромосомной ДНК. В результате одиночного кроссинговера (X) происходит интеграция в хромосому всей плазмиды вместе с включенным в нее геном. [c.124]

Для переноса мигрирующих элементов между клетками нужен переносчик, которым могут быть определенные плазмиды или фаги. Встраивание мигрирующих элементов в бактериальную хромосому оказывает мутагенное действие, так как при этом происходит включение фрагмента ДНК, приводящее к изменению порядка расположения нуклеотидов в триплете и, как следствие этого, нарушению процесса транскрипции. [c.145]

Молекула вектора должна отвечать определенным требованиям быть небольшой, содержать уникальные участки расщепления рестрикционными эндонуклеазами, иметь маркеры для оптимальной селекции рекомбинантных клеток. В качестве векторов для включения чужеродной ДНК в клетки Е. соИ используются плазмиды (термин предложен Дж. Ледербергом) и бактериофаги. И те и другие являются репликонами. [c.430]

Включение фрагмента чужеродной ДНК в векторную плазмиду [c.195]

Включение фрагмента чужеродной ДНК в вектор осуществляют по следующей схеме (рис 686) Многие плазмиды несут транспозоны [c.198]

Первое преимущество обеспечивает микробным клеткам лучшие возможности для изменения и перестроек наследственного материала, например, включение в него чужеродной генетической информации, привнесение в клетки или, напротив, элиминация из них плазмид, и пр. [c.375]

Гли - гранулы гликогена Ж -жгутик Кпс - капсула КСт - клеточная стенка Ли - липидные капельки ПГМ - поли-Р-гидроксимасляная кислота Пи - пили Плз - плазмида ПМ — плазматическая мембрана ПФ — гранулы полифосфата Ри - рибосомы и полисомы Я -- ядро (нуклеоид) 8 - включения серы [c.39]

Транспозоны могут служить маркером гена, предназначенного для клонирования. Как известно, при клонировании хромосомных генов бактерий иногда возникают сложности, связанные с тем, что нет простого метода, позволяющего выявить, какая из плазмид, несущих встроенный фрагмент хромосомной ДНК, содержит интересующий исследователя ген. Иногда эту проблему удается решить, выделив сначала мутант по этому гену с включенным в него или расположенным поблизости транспозоном. [c.308]

В 1977 г. Чилтон с сотр. доказали, что опухоли корончатого галла возникают в результате включения определенного фрагмента Ti-плазмиды агробактерии в растительную ядерную ДНК. [c.91]

Геном эукариот обладает способностью накапливать дополнительные последовательности экзогенного или эндогенного происхождения. Такие последовательности независимо от того, добавлены ли они извне или имеют хромосомное происхождение, могут давать начало множественным копиям, которые существуют в виде тандемных последовательностей либо вне хромосомы, либо в составе хромосом. Находясь вне хромосом, дополнительный материал наследуется неравномерно (он не сегрегирует поровну прй делении, как это свойственно истинным плазмидам). Материал, включенный в геном хозяина, является его компонентом. [c.497]

В течение многих лет было известно, что гены и даже целые участки хромосом высших о,рганизмов могут иногда перемеш,аться с одного места на другое. В случае кукурузы контролирующиеэлементы перемещаются с одного участка на другой, изменяя выражение генов и напоминая своим поведением способных к включению бактериальных плазмид [233с]. Не исключено, что это явление связано с присутствием в ДНК эукариот большого числа длинных палиндромных последовательностей [235а]. [c.288]

X [260]. Аналогичным образом гены gfai-оперона Е. соН удалось включить при помощи фага % в геном вируса SV40. Важная особенность зтих методов состоит в том, что в них используется молекулярное клонирование новых комбинаций ДНК, включенных в бактериальную плазмиду [261]. Для этой цели были использованы плазмиды, способные к репликации в клетках Е. соИ. [c.295]

В бактерии посредством Т. можно ввести также ДНК плазмид. Конечным результатом этого является возникновение клетки, несущей чужеродную плазмиду в автономном состоянии или включенную в состав хромосомы. Механизм проникновения в клетку плазмидной ДНК такой же, как и хромосомной. Однако возникновение однонитевой ДНК и др. процессы, сопутствующие поглощению, настолько уродуют плазмиды, что вероятность правильного восстановления кольцевой реплицирующейся формы низка (Т. клетки мономерными формами плазмид не эффективна). Поэтому употребляют мультимерные (состоящие из неск. плазмид) формы или плазмиды с прямыми повторами нуклеотидов, отчего шансы на сборку полноценной плазмиды повышаются. [c.626]

Рис. 22.5.4. Включение гена препроинсулина в бактериальную плазмиду из мРНК через кольцевую ДНК, связывание, рестрикционное расщепление, отжиг

Последняя стадия этого процесса заключается в отжиге плазмиды и гена инсулина с образованием кругового дуплекса, который имеет четыре однонитевых разрыва. Последние защиваются ферментом лигазой, что приводит к образованию замкнутой кольцевой ДНК плазмиды. Она амплифицируется клонированием, давая достаточное количество копий для анализа последовательности ДНК. Проведенный анализ показал, что произошло включение 353 нуклеотидов гена препроинсулина. [c.214]

К счастью, правильно спланировав эксперимент, можно минимизировать влияние метаболической перегрузки, оптимизировать выход рекомбинантного белка и повысить стабильность трансформированных хозяйских клеток. Например, нагрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмидные векторы. А еще лучше вообще отказаться от векторов и встроить чужеродную ДНК в хромосомную ДНК организма-хозяина. В этом случае не нужно заботиться об обеспечении стабильности плазмиды. Кроме того, клетке не приходится расходовать свои ресурсы на синтез ненужных продуктов, кодируемых маркерными генами устойчивости к антибиотикам. Синтез продуктов таких генов, входящих в состав плазмидных векторов наряду с генами-мишенями, является одной из основных причин метаболической перегрузки. Интеграция в хромосому особенно важна в тех случаях, когда используется сам рекомбинантный микроорганизм, а не синтезируемый им продукт. Уменьшению метаболической перегрузки помогает также применение сильных, но регулируемых промоторов. В таких случаях ферментацию проводят в две стадии. На первой из них, во время роста, промотор, контролирующий транскрипцию гена-мишени, выключен, а на второй, во время индукции, -включен. [c.128]

Свойства любого белка зависят от его конформации, которая в свою очередь определяется аминокислотной последовательностью. Некоторые аминокислоты в полипептидной цепи играют ключевую роль в определении специфичности, термостабильности и других свойств белка, так что замена единственного нуклеотида в гене, кодирующем белок, может привести к включению в него аминокислоты, приводящему к понижению его активности, либо, напротив, к улучшению каких-то его специфических свойств. С развитием технологии рекомбинантных ДНК появилась возможность производить специфические замены в клонированных генах и получать белки, содержащие нужные аминокислоты в заданных сайтах. Такой подход получил название направленного мутагенеза. Как правило, интересующий исследователя ген клонируют в ДНК фага M13. Одноцепочечную форму ДНК этого фага копируют с использованием олигонуклеотидного праймера, синтезированного таким образом, чтобы в ген-мишень был встроен определенный нуклеотид. Затем трансформируют двухцепочечными ДНК M13 клетки Е. соИ. Часть образующихся в клетках фаговьгх частиц несет ген, содержащий нужную мутацию. Такие частицы идентифицируют, встраивают мутантный ген в экспрессирующий вектор, синтезируют белок и определяют его активность. Вносить изменения в клонированные гены можно также с помощью плазмид или ПЦР. Обычно заранее не известно, какую [c.175]

Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в клетки животно-го-мишени гена, кодирующего белок-антиген. В первых экспериментах такого рода Е. соН-плазмиду, содержащую клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора вируса животных, конъюгировали с микрочастицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши. Впоследствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с большим количеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК. Для этого необходимо в 10 -10" раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов более чем в 75% случаев ген включался в клетки мыши, и синтезированный белок-антиген индуцировал синтез антител. Этот подход позволяет избежать очистки антигена, что требует много времени и средств, или использования для соз- [c.233]

Рис. 147. Последовательность событий при использовании вирусной (вироидной) РНК в качестве вектора 1 — обратная транскриптаза, 2 — ДНК-полимераза, 3 — встраивание в плазмиду (клонирование), 4 — включение чужеродного гена, 5 — инфицирование растений, б — транскрибирование с образованием инфекционной РНК и последующее заражение расте-ния-хозяина.

Другие методы идентификации рекомбинантных плазмид основаны на экспрессии включенного в них гена. При этом идентифицируется белковый продукт, для чего используются иммунологические методы или методы определения его специфической активности. Для обнаружения антигенов в бактериях путем скрининга, на основе специфического их взаимодействия с антителами, часто используется метод, разработанный Брумом и Джилбертом. Для этого пластиковый диск покрывают слоем специфических радиоактивных антител и помещают его на предварительно лизированные колонии. Антигены из лизиро-ванных бактерий связываются с антителами на диске. Положение антигенов, адсорбированных на диске, определяют с помощью радиоавтографии. [c.316]

Некоторые разновидности почвенной бактерии Agroba terium tumefa iens способны внедряться в ткани двудольных растений через раневые поверхности и вызывать образование опухолей — корончатых галлов. Хотя об этом явлении известно с 1907 г., механизм патогенности удалось установить совсем недавно. Было показано, что клетки патогенных штаммов этой бактерии содержат крупную плазмиду (Ti) с мол. массой от 90-10 до 150-10 , зависящей от того, какие иные свойства, кроме патогенности, в ней закодированы. Имеются данные, что превращение нормальных клеток растения в опухолевые обусловлено переносом в них плазмиды Ti и включением ее в хромосомную ДНК хозяина. [c.373]

Рис. 2,4. А. Схема строения прокариотической клетки (бактериальная клетка в продольном разрезе). Глн-гранулы гликогена Ж-жгутик Кпс-капсула КСт-клеточная стенка Л -липидные капельки ЯГМ-поли-Р-гидроксимаслЯ" ная кислота Яы-пили Ялз-плазмида ЯМ-плазматическая мембрана ЯФ-гранулы полифосфата Рм-рибосомы и полисомы Я-ядро (нуклеоид) 5-включения серы. Б, Различные цитоплазматические структуры.

Как было установлено около 15 лет назад, некоторые мутации, спонтанно возникающие у Es heri hia oli, объясняются включением чужеродной ДНК. Такие мутации происходят в структурных и регуляторных генах по всей хромосоме. Чужеродная ДНК представляет собой так называемые инсерционные последовательности (IS-элементы) они встречаются как в бактериальных хромосомах, так и в плазмидах. IS-эле-менты состоят из 800-1400 пар нуклеотидов распознаваемых фенотипических признаков они не кодируют, и об их функциях мало что известно. Мутагенное действие их обусловлено просто включением посторонней ДНК, нарушающим процесс транскрипции (с. 447). Можно предполагать, что IS-элементы играют важную роль в перестройках генетического материала. [c.455]

Рис. 15.21. Получение гибридной ДНК путем вставки фрагмента эукариотической ДНК в бактериальную плазмиду (упрощенная схема). Чужеродную ДНК и ДНК плазмиды расщепляют in vitro с помощью одной и той же рестрикционной эндонуклеазы. При этом получаются фрагменты с липкими концами (одноцепочечными концевыми участками с комплементарными основаниями). В результате смешивания таких фрагментов и обработки лигазой образуются плазмиды с включенной в них эукариотической ДНК. Эти гибридные ДНК можно вводить в подходящие бактерии и размножать, получая массовые культуры трансформированных клонов. Из такого клона удается выделить чужеродную ДНК.

Мы точно не знаем, какая особенность последовательности ДНК в пределах этой границы необходима для узнавания РНК-полимеразой. Поскольку стартовая точка далеко не всегда попадает в эту область, можно заключить, что от геометрии комплекса зависит, в каком месте происходит инициация. Возможно, когда фермент связывается слева от стартовой точки, комплекс способен вытягиваться по направлению хода транскрипции. Блок ТАТА всегда расположен внутри промоторной области его особое значение для транскрипции подтвердилось в опытах с введением двух мутаций в ген, кодирующий ко-нальбумин у цыпленка. Замена Т в третьей позиции блока Хогнесса на G приводит к возникновению мутации, сильно ослабляющей транскрипцию гена. Эффект этот обусловлен не просто изменением состава пар оснований, так как замена, приводящая к появлению А, оказывает такое же действие (при этом только изменяется ориентация пары Т—А). Следовательно, важное значение имеет, видимо, точная последовательность блока ТАТА. Как было показано, этой области достаточно для инициирования транскрипции in vitro. Об этом свидетельствует тот факт, что последовательность положения от — 32 до — 12, относящаяся к области поздних генов транскрипционной единицы аденовируса, встроившись в различные участки ДНК бактериальной плазмиды, способна инициировать транскрипцию на расстоянии 30 п. н. от места своего включения. [c.150]

Рекомбинантные плазмиды, в которые включен участок ДНК длиной около 1 т.п.н. из области ori , поддерживаются в клетках Е. соИ в количестве 1-2 копий на бакте- [c.398]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология