Фиксация после электрофореза

Он выполняется следующим образом. На середину полоски плотной, гомогенной фильтровальной (хроматографической) бумаги, пропитанной буферным раствором с определенным значением pH, наносят каплю исследуемого коллоидного раствора. Затем на полоску бумаги накладывают разность потенциалов. Под влиянием образующегося электрического поля отдельные компоненты, содержащиеся в капле, обладающие разными электрофоретическими подвижностями, передвигаются по полоске с различными скоростями. Через некоторое время компоненты распределяются на бумаге в виде стольких зон, различно удаленных от исходной точки, сколько компонентов содержалось в растворе. Полоску высушивают и прогревают для денатурации и фиксации находящихся на ней белков и после этого окрашивают подходящими красителями. В результате проявляется распределение компонентов по длине полоски. Роль бумаги в этом методе сводится к устранению диффузионного и конвекционного перемешивания белков при электрофорезе. [c.210]

Во всех описанных способах белки перед окрашиванием или в его процессе фиксируют осаждением кислотой и спиртом. Однако некоторые основные белки (например, рибонуклеаза и протамин), а также низкомолекулярные пептиды и гормоны при такой обработке не осаждаются, а, наоборот, растворяются и вымываются из геля. Недавно был предложен принципиально иной подход к фиксации белков и пептидов в геле после электрофореза. Гель в течение 1 ч вымачивают в 5%-ном растворе формальдегида в 25%-НОМ этаноле с добавлением СВВ R-250 до 0,11%. В этих условиях формальдегид ковалентно сшивает пептиды с матрицей геля за счет образования метиленовых мостиков между аминогруппами аминокислот и первичными аминами ПААГ. На приведенных в работе фотографиях можно видеть разительный эффект обнаружения щелочных и низкомолекулярных белков гели, кажущиеся пустыми при обычном окрашивании, на самом деле содержат множество белковых полос. Гели с ДДС-Na красят более продолжительное время (до 3 ч) в 3,5%-ном рас- [c.93]

Описанные в настоящей главе методы можно использовать для обнаружения, а в некоторых случаях и для количественного определения белков после их разделения с помощью электрофореза в средах, содержащих обычные буферные растворы. В присутствии высоких концентраций таких добавочных агентов, как ДСН или мочевина, следует уделять особое внимание правильной фиксации белков. Амфолиты-носители, применяемые при изоэлектрофокусировании, создают дополнительные трудности, так как образуют со многими белковыми красителями нерастворимые комплексы. Поэтому при наличии в растворах указанных добавок необходимо применять модифицированные методы окрашивания. Некоторые примеры окрашивания белков после электрофореза в присутствии ДСН или амфолитов-носителей приведены в главах, посвященных соответствующим методам разделения. [c.278]

Разделившиеся зоны биополимеров во избежание их диффузии немедленно фиксируют. Для этого гель извлекают из стеклянной формы и вымачивают в смеси кислоты со спиртом так, что белки или нуклеиновые кислоты выпадают в осадок в том самом месте, где закончилась их миграция в ходе электрофореза. После фиксации (или одновременно с ней) проводят окрашивание зон путем вымачивания геля в растворе красителя, прочно связываюш егося с белком или нуклеиновой кислотой. Излишек красителя удаляют. На фотографии окрашенного цилиндрического ПААГ (рис. 2) хорошо видны четкие, узкие полосы разделившихся компонентов исходной смеси белков. [c.5]

Для выявления области геля, содержащей гибридный белок, после электрофореза вымочите гель в охлажденном 0,1 М КС1. Холодный раствор, содержащий ионы К+, преципитируют ДСН в дорожках геля, в результате чего появляются соответствующие фракционированным белкам белые полосы. Такую полосу, соответствующую гибридному белку, можно вырезать из геля острой бритвой. Это устраняет необходимость фиксации и окраски кумасси полосы геля с исследуемым белком или параллельных дорожек геля. [c.157]

Обнаружение и локализацию белковых зон после их разделения электрофорезом в ПААГ в большинстве случаев осуществляют путем их прокраски в геле. Зоны проявляются как окрашенные полоски или пятна различной интенсивности, в зависимости от содержания в них белка. Для окраски гель вымачивают в растворе красителя, который диффундирует внутрь него и прочно связывается с белками. Процесс диффузии, как правило, занимает несколько часов. Во избежание размывания полос за это время белки иногда предварительно фиксируют осаждением. Для этого гель сначала вымачивают в 10%- или 50%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ). Чаще фиксацию совмещают с окрашиванием, используя раствор красителя в. смеси уксусной кислоты и метанола или в ТХУ. [c.88]

Н. Андерсон) рекомендуют использовать всю, очень стабильную совокупность белков сердца крысы. Подробно описана воспроизводимая процедура получения соответствующего гомогената. Его подмешивают к агарозе, которой заливают цилиндрик геля первого направления при фиксации его по торцу пластины второго направления. Равномерно распределенные по всей длине цилиндрика, белки сердца после электрофореза во втором направлении образуют на пластине ряд параллельных полос. 80 характерных полос этого набора пронумерованы от нижнего до верхнего края пластины. Они перекрывают щирокий диапазон молекулярных масс, так что с ними можно соотносить положе- [c.57]

После электрофореза можно хранить гель на том же стекле, обернув его целлофаном, или предварительно перенести на металлическую фольгу. Можно положить на гель фильтровальную бумагу, которая хорошо к нему прилипает, и снять стекло. На этой же бумаге (после фиксации и окрашивания) гель можно и высушить. [c.35]

Разновидность метода — бумажный электрофорез, оформление которого значительно проще. В этом методе на полоску однородной непроклеенной бумаги, пропитанной буферным раствором, наносят каплю исследуемого раствора. Концы полоски погружают в сосуды с электродами, заполненные тем же буферным раствором. Под действием поля компоненты движутся с различными скоростями (пропорциональными ) и через некоторое время наступает пространственное их разделение и проявление в виде отдельных пятен после фиксации специальным проявителем. По интенсивности пятен и сдвигу их от начального уровня можно оценить состав и концентрации компонентов в исходном растворе. [c.199]

В зависимости от типа приборов электрофорез на бумаге обычно длится от 4 до 16 ч. Если используется общераспространенный буферный раствор Михаэлиса, то белки сыворотки дают 5 четко разграниченных фракций. После фиксации полоски бумаги можно легко обработать красителями, специфичными для белков, липо- или гликопротеидов. Окрашенные полоски можно хранить или, разрезав на участки, элюировать для фотометрического определения каждой фракции. Электрофорез на бумаге хорошо себя зарекомендовал в повседневной работе клинической лаборатории. [c.12]

Фиксация и окраска белков на бумаге. Большинство исследователей после окончания электрофореза перед дальнейшей обработкой прогревают электрофореграммы в течение 15—20 минут. Однако более правильно прогревать их в течение 5 минут при 80—90°, как рекомендует А. П. Вишняков. Наиболее распространены следующие методы окраски [c.114]

Если на полоску фильтровальной бумаги нанести каплю нормальной сыворотки крови, то после электрофореза при pH 8,6, продолжающегося от 18 до 24 часов, и последующей фиксации и окраски на электрофореграмме можно наблюдать 5 различающихся между собой полос. На наибольшем расстоянии от места нанесения образца по направлению к аноду расположена фракция альбумина, затем следуют ар и ая-глобулийы, 3-глобулин и углобулин (рис. 7). [c.33]

По окончании электрофореза рекомендуется как можно быстрее провести фиксацию разделенных веществ путем их осаждения или высушивания, так как диффузия молекул продолжается и после отключения электрического тока, что приводит к ухудшению картины разделения. Бумагу и пленки из ацетата целлюлозы обычно высушивают, в случае же крахмального и полиакриламидного геля применяют осаждение разделенных веществ. Следует заметить, что пластины агарового и агарозного гелей, а также тонкие слои полиакриламидного геля тоже можно высушивать, но это, как правило, занимает много времени и, следовательно, нецелесообразно. [c.186]

В первоначальных экспериментах после завершения электрофореза гель во избежание диффузии полос ДНК в замороженном виде экспонировали на рентгеновскую пленку. Однако в этом случае присутствующие в геле вода и мочевина способствовали гашению радиоактивных сигналов и полосы ДНК на радиоавтографе получались нечеткими. Введенный впоследствии этап фиксации олигонуклеотидов в геле с помощью 10%-ной уксусной кислоты, кроме перевода нуклеиновых кислот в нерастворимую форму, удалял мочевину. Уже упоминавшийся выше маркерный краситель - бромфеноловый синий - является рН-ин-дикатором и в тех случаях, когда он не успевает выйти и остается в геле, по изменению его окраски с фиолетово-синей на желто-коричневую можно судить об изменении кислотности среды в самом геле. Последу- [c.184]

Для электрофореза в полиакриламидном геле используются разнообразные выпускаемые промышленностью и самодельные приборы. Мы предпочитаем те приборы, которые позволяют проводить разделение в тонких пластинах геля, что обеспечивает оптимальное разрешение. Лучшее разрешение на пластинах обусловлено тем, что возникающее во время электрофореза тепло здесь легко рассеивается, а также тем, что гель после электрофореза можно быстро фиксировать. Последнее важно для того, чтобы свести к минимуму диффузию белка в полосах. Пластины позволяют одновременно сравнивать много проб, и их легко сохранять после высушивания на листах фильтровальной бумаги. Радиоактивность в пробах выявляют радиоавтографией и фотофлюорографией, а высушенные на фильтровальной бумаге гели можно легко нарезать ножницами или резаком и после повторного насыщения водой вырезанных сухих полосок просчитывать на сцинтилляционном счетчике. Если не требуется большая разгонка в геле, электрофорез, фиксацию, окраску и высушивание успевают проводить за один день. [c.156]

Электрофорез окажется, повидимому, наиболее полезным в области биохимии в качестве метода очистки белков, антител, ферментов, гормонов, вирусов и т. п. При изучении антител, концентрация которых допускает их наблюдение на диаграммах, можно установить расположение и концентрацию антител путем сравнения изображений, полученных до и после осаждения антител специфическими антигенами. Этот случай изучали ва гиперим-мунной лошадиной и кроличьей сыворотках [55—57]. Однако в большинстве случаев концентрация антител лежит ниже предела чувствительности прибора. В таких случаях необходимо прибегать к исследованию выделенных проб (см. стр. 360) при помощи методов дополнительной фиксации, агглютинации, нейтрализации и т. п. [58—60]. [c.377]

После электрофореза в присутствии ДДС-Ыа гель окрашивают, как обычно, например, в 0,25%-ном растворе СВВ К-250 (см. ниже) в 9%-ной уксусной кислоте, содержащей 45% метанола, в течение нескольких часов при комнатной температуре, а затем отмывают в 7,5%-ной уксусной кислоте с 5% метанола и добавкой ионообменника АО 501x8 для связывания красителя. Фиксация белков идет одновременно с их окрашиванием. Однако следует иметь в виду, что ДДС-Ыа является эффективным детергентом и препятствует осаждению, а следовательно, и фиксации белков. Д я малых белков фиксация при окрашивании может оказаться ненадежной. Их лучше фиксировать предварительно, вымачивая гель в 10%-ной трихлоруксусной кисло-,те (ТХУ). ДДС-Ыа, находясь в комплексе с белком, еще и препятствует в некоторой мере самому процессу окрашивания. 10%-ная ТХУ частично отмывает белок от ДДС-Ыа. Еще лучше это можно делать, вымачивая гель в 50%-ном растворе ТХУ (в течение ночи). Изопропанол ускоряет вымывание ДДС-Ыа, поэтому его целесообразно включить в фиксирующий белки раствор. [c.64]

Один из способов идентификации нужного фермента среди многих компонентов, разделившихся в процессе электрофореза, состоит в специфическом окрашивании этого фермента. Естественно, такой способ можно применять только в тех случаях, когда электрофорез проводят в неденатурирующих условиях и, следовательно, он не пригоден для выявления ферментов после электрофореза в присутствии мочевины или ДСН. Кроме того, процедуру идентификации фермента следует проводить без предварительной фиксации белковых полос, и тем не менее используемые реагенты должны успеть продиффундировать в гель прежде, чем произойдет диффузия самого фермента. Наиболее удовлетворительные результаты дают те методы, в которых гель разрезается по толщине на тонкие пластины (рис. 9.6), благодаря чему полосы белков оказываются на поверхности и необходимость в длительной диффузии реагентов в гель отпадает. Лучше всего для этого подходят крахмальные или полиакриламидные (толстые) пластины после проведения простого гель-электрофореза, электрофореза в градиентных гелях н изоэлектрического фокусирования. [c.327]

Фиксация и окраска электрофореграмм. По окончании электрофореза выключают ток и тотчас вынимают электрофореграммы из прибора. Их располагают на специальной подставке и подсушивают на воздухе под тягой, затем — в сушильном шкафу при 105 °С в течение 20 мин для фиксации белков на бумаге, после чего помещают в эмалированную кювету, заливают красителем п оставляют на 2—3 ч и более. Краситель сливают и электрофореграммы отмывают от его избытка, заливая 3—4 раза 2%-ным раствором уксусной кислоты, каждый раз на 5—10 мин. Участки бумаги, не содержащие белка, должны быть полностью освобождены от красителя. Для закрепления окрашенных продуктов электрофореграммы на 2 мин заливают 2%-ным раствором уксуснокислого натрия и сушат на воздухе под гягой. [c.91]

При необходимости можно провести количественное определение некоторых аминокислот в исследуемом образце, например аланина и глицина, которые хорошо отделяются от других аминокислот. Для количественного определения аланина и глицина на электрофореграмму, помимо исследуемого образца, наносят разные количества этих амино-кислот- свидетелей (20—140 нмоль). После окончания электрофореза, прокрашивания и фиксации вырезают пятна соответствующих аминокислот и обрабатывают их так, как описано на с. 132. Колориметри-рование проводят при 500 нм и строят график зависимости оптической плотности от количества внесенной аминокислоты. Используя полученный график, определяют содержание глицина и аланина в исследуемом образце. [c.139]

Недавно было показано [Ja kie, 1978], что все эти трудности можно обойти путем кратковременной фиксации и окраски белковых полос в цилиндрике геля после ИЭФ таким образом, чтобы это не мешало последующему электрофорезу. По окончании ИЭФ по О Фарреллу белки фиксировали и окрашивали в течение 10 мин 0,1%-ным СВВ R-250 в растворе, содержащем 10% Hj OOH и 50% метанола. Отмывали гель 1 ч в том же растворителе, а затем в смеси, содержащей 7% СН,СООН, 5% метанола и 0,005% СВВ R-250 (последнее для предотвращения десорбции красителя с белка). Фиксированный таким образом цилиндрик геля можно хранить неделями. Перед фракционированием во втором направлении цилиндрик в течение 2 ч вымачивали в 5 мл раствора, содержащего 0,625 М Трис-НС1 (pH 6,5), 2,3% ДДС-Na, 5% -меркаптоэтанола и 10% глицерина, а далее проводили электрофорез так, как описано О Фарреллом. При выдерживании геля в 2,3%-ном ДДС-Na [c.48]

Так, один из путей увеличения числа читаемых полос ДНК состоял в соответствующей подготовке полиакриламидного геля после завершения электрофореза к радиоавтофафии. Исключение диффузии фрагментов ДНК, достигаемое их фиксацией с помощью уксусной кислоты, и одновременное удаление мочевины позволили несколько повысить чувствительность и разрешающую способность метода. Более значительное улучшение было достигнуто путем удаления воды и экспонированием предварительно высушенного геля. [c.195]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология