Ген маркерные

Рис. 6.8. Очистка химерного белка с помощью иммуноаффинной хроматографии. Антитела к маркерному пептиду химерного белка фиксируют на твердом носителе и пропускают через колонку химерный белок. Маркерный пептид, входящий в состав химерного белка, связывается с антителами, а все остальные белки свободно проходят через колонку. Очищенный химерный белок элюируют из колонки.

В качестве маркерных ферментов в полученных фракциях измеряют активности цитохромоксидазы (специфическая локализация — [c.411]

Если вектор представляет собой плазмиду, реплицирующуюся независимо от хромосомы, то он должен содержать сайт инициации репликации, функционирующий в хозяйской клетке. Если же вектор предназначен для встраивания в хозяйскую хромосомную ДНК, то для обеспечения рекомбинации он должен нести последовательность, комплементарную определенному участку хромосомной ДНК хозяина (хромосомный сайт интеграции). Поскольку технически многие операции с рекомбинантными ДНК сложнее проводить в клетках эукариот, чем прокариот, большинство эукариотических векторов сконструированы как челночные. Другими словами, эти векторы несут два типа сайтов инициации трансляции и два типа селективных маркерных генов, одни из которых функционируют в Es heri hia oli, а другие — в эукариотических хозяйских клетках. Такие векторные системы экспрессии разработаны для дрожжей, насекомых и клеток млекопитающих. [c.136]

Разумеется, для лучшего понимания процесса литья под давлением необходимо решение задачи фонтанного течения на участке фронта потока. Это трудная задача, особенно для случая неизотермического течения вязкоэластических жидкостей. Поскольку эта задача относится к категории задач со свободными границами, то ее можно решать с помощью либо маркерного метода [33], либо ме- [c.534]

Содержать один или несколько маркерных генов, которые после проникновения вектора в клетку придают ей фенотип, свидетельствующий о присутствии вектора. [c.117]

В частности, для бактериальных векторов в качестве маркерных генов чаще всего используются гены, вызывающие устойчивость клеток к некоторым антибиотикам. [c.117]

Чтобы определить относительную молекулярную массу разделенных фрагментов, одновременно проводят электрофорез маркерных макромолекул с известными молекулярными массами. Набор маркеров должен охватывать весь диапазон молекулярных масс в данной системе. Образец маркерных молекул вносят в отдельную лунку, расположенную вблизи одного из краев пластинки (или в две лунки у двух разных краев). Логарифм относительной молекулярной массы маркера линейно связан с его электрофоретической подвижностью Rf — величиной, равной отношению расстояний, пройденных маркерной молекулой и красителем (фронтом растворителя). Построив график зависимости логарифма относительных молекулярных масс маркеров от Кр можно найти относительную молекулярную массу каждого компонента образца. Относительная мол. масса белков измеряется в Дальтонах, двухцепочечных нуклеиновых кислот — в числе пар нуклеотидов, одноцепочечных — в числе нуклеотидов. [c.54]

Для получения больших количеств чужеродных белков с помощью рекомбинантных штаммов Е. соИ бьша сконструирована плазмида pPL 2833. Она содержит сильный промотор, селективный маркерный ген и короткий участок с несколькими уникальными сайтами для рестрицирующих ферментов (полилинкер), следующий непосредственно за промотором. Эффективность этого экспрессирующего вектора в осуществлении синтеза чужеродных белков в Е. соН можно еще [c.108]

Антитела к маркерному пептиду [c.115]

Традиционные процедуры диагностики возбудителей инфекции опираются либо на набор характеристик патогенного микроорганизма, либо, что предпочтительнее, на одну уникальную, легко различимую его особенность. Клинические микробиологи пытаются найти тот минимальный набор биологических характеристик, при помощи которого можно будет гарантированно обнаруживать и идентифицировать патогенные микроорганизмы. Например, некоторые возбудители вырабатывают специфические биохимические соединения, которые и необходимо обнаружить в биологическом образце. Часто подобную маркерную молекулу можно выявить непосредственно, проведя высокоспецифичный биохимический анализ. Но такой подход неизбежно приведет к увеличению числа индивидуализированных систем детекции патогенных микроорганизмов. Более предпочтительным был бы универсальный метод, позволяющий выявлять любую маркерную молекулу независимо от ее химической природы. Именно таким является метод, основанный на идентификации комплексов антиген-антитело. [c.182]

К счастью, правильно спланировав эксперимент, можно минимизировать влияние метаболической перегрузки, оптимизировать выход рекомбинантного белка и повысить стабильность трансформированных хозяйских клеток. Например, нагрузку можно снизить, если использовать малокопийные плазмидные векторы. А еще лучше вообще отказаться от векторов и встроить чужеродную ДНК в хромосомную ДНК организма-хозяина. В этом случае не нужно заботиться об обеспечении стабильности плазмиды. Кроме того, клетке не приходится расходовать свои ресурсы на синтез ненужных продуктов, кодируемых маркерными генами устойчивости к антибиотикам. Синтез продуктов таких генов, входящих в состав плазмидных векторов наряду с генами-мишенями, является одной из основных причин метаболической перегрузки. Интеграция в хромосому особенно важна в тех случаях, когда используется сам рекомбинантный микроорганизм, а не синтезируемый им продукт. Уменьшению метаболической перегрузки помогает также применение сильных, но регулируемых промоторов. В таких случаях ферментацию проводят в две стадии. На первой из них, во время роста, промотор, контролирующий транскрипцию гена-мишени, выключен, а на второй, во время индукции, -включен. [c.128]

К фиксированному образцу добавляют антитело, специфичное к маркерной молекуле (первое антитело), затем промывают лунку, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы первого антитела (рис. 9.1, ). [c.183]

Дают пятнам высохнуть и затем помещают конец бумаги,, ближайший к базовой линии, во внутреннее отделение кюветы, связанное с анодом, а другой конец бумаги — во внутреннее отделение кюветы, связанное с катодом. С помощью кисти смачивают бумагу проводящей жидкостью, начиная с концов бумаги в направлении базовой линии. Не смачивают полоску, на которой находится нанесенное вещество. Закрывают крышку и дают жидкости диффундировать через базовую линию если необходимо, закрывают прибор, чтобы защитить его от действия света, соединяют кабель с источником энергии и включают ток. Доводят напряжение примерно до 20 В на 1 см бумаги между кюветами и дают процессу протекать в течение указанного времени или до тех пор, пока маркерное вещество не пройдет определенное расстояние. Выключают ток, вынимают бумагу, высушивают в токе воздуха, защищая, если необходимо, от действия света, и оценивают полученную элек-трофореграмму в условиях, описанных в статье. Если статьей предписано применение маркерного вещества, результат испытания считается достоверным только в том случае, если это вещество продвинется от базовой линии на указанное расстояние. Если интенсивность любого дополнительного пятна, полученного с испытуемым веществом, меньше, чем интенсивность пятна, полученного с раствором стандартного образца, вещество соответствует требованиям. Если указано в статье, опрыскивают бумагу равномерно с обеих сторон реактивом, проводят дальнейшую предписанную обработку для завершения реакции и применяют те же критерии для оценки полученных пятен. [c.117]

Добавляют второе антитело, которое специфически связывается с первым антителом и не взаимодействует с маркерной молекулой (рис. 9.1, В). К этому антителу присоединен фермент (например, шелочная фосфатаза, пероксидаза или уреаза), катализирующий превращение неокрашенного субстрата в ок- [c.183]

Отсюда следует вывод, что определение молекулярной массы нативиых белков с помощью гель-фильтрации, даже проведенное на уровне описанного выше современного подхода к этой задаче, может дать лишь приближенный результат. Тем более это справедливо в случае весьма распространенного упрощенного способа использования калибровочных кривых, построенных по молекулярным массам маркерных белков без учета их формы. То же относится к определению гель-фильтрацией молекулярных масс нативных нуклеиновых кислот с помощью маркерных НК известной массы, когда в число таких маркеров тРНК включают наряду с рибосомаль-пыми РНК, а нередко и фрагментами ДНК. Говорить же серьезно [c.150]

Гидролиз примерно 20 мкг Р-РНК рибонуклеазами Т1 или А (1 мкг) воли в капилляре, в объеме 3—5 мкл на старт полоски ацетилцеллюлозы наносили всю иикубацноииую смесь. Электрофорез вели в кислом водио-оргаиическом буфере (pH 3,5), содержащем 0,5% пиридина, 5% СН3СООН и 7,5 М мочевины. Полоску размером 3 X 55 см предварительно замачивали — клали иа открытую поверхность буфера, давая возможность жидкости постепенно впитываться в материал полоски с нижией ее поверхности так удавалось избежать задержания в сетке ацетилцеллюлозы микропузырьков воздуха. Затем один конец полоски подсушивали и наносили нрепарат на старт, в 10 см от конца. По обеим сторонам от препарата наносили маркерные красители (метилоранж, фуксин и ксилепциа- [c.496]

Наряду с активностью аспартатаминотрансферазы в каждом случае определяют активность малатдегидрогеназы — маркерного фермента матрикса митохондрий. [c.353]

Рис. 7.17. Двухцистронный экспрессирующий вектор. Клонированные гены (а и (3) кодируют субъединицы димерного белка (а 3). Они разделены сегментом ДНК, который после транскрипции, на уровне мРНК, играет роль внутреннего сайта связывания рибосом. Каждый ген находится под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра). Трансляция мРНК начинается с 5 -конца и с внутреннего сайта (угловые стрелки). Синтезированные субъединицы объединяются с образованием функционального димерного белка. Вектор содержит сайты инициации репликации, функционирующие в Е. соИ orf) и в клетках млекопитающих (orF y, селективный маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. соИ селективный маркерный ген (СМ), находящийся под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра).

Искусственные дрожжевые хромосомы (YA ) предназначены для клонирования больших фрагментов ДНК (100 т. п. н.), которые затем поддерживаются в дрожжевой клетке как отдельные хромосомы. УАС-система чрезвычайно стабильна. С ее помощью проводили физическое картирование геномной ДНК человека и анализ больших транскриптонов, создавали геномные библиотеки, содержащие ДНК индивидуальных хромосом человека. YA -вектор напоминает хромосому, поскольку он содержит последовательность, функционирующую как сайт инициации репликации ДНК (автономно реплицирующуюся последовательность), сегмент центромерной области дрожжевой хромосомы и последовательности, образующиеся на обоих концах при линеаризации ДНК и действующие как теломеры, обеспечивающие стабильность хромосомы (рис. 7.3). При встраивании чужеродной ДНК в YA может происходить нарушение рамки считывания маркерного дрожжевого гена. В результате продукт этого гена не образуется, и при выращивании клеток на специальной среде можно наблюдать цветную реакцию. Кроме того, некоторые YA -векгоры несут селективный маркер, независимый от сайта клонирования. Несмотря на все преимущества, YA пока не использовались для промышленного синтеза гетерологичных белков. [c.137]

В. subtilis. На этапе 1 в хромосомную ДНК хозяйской клетки с помощью гомологичной рекомбинации встраивают маркерный ген. На этапе 2 маркерный ген замещают геном-мишенью. Аналогичную операцию повторяют для других сайтов. [c.125]

В. subtilis в составе плазмиды, включали в хромосомную ДНК с помощью рекомбинации, заменив им маркерный ген. Отбирали клетки, которые уже не экспрессировали маркерный ген, т. е. несли вместо него ген-мищень, интегрированный в хромосомную ДНК. Для интеграции других копий гена-мищени в хромосомную ДНК хозяйской клетки повторяли эту процедуру, используя другие несущественные области ДНК. [c.126]

Селективные маркерные гены Для отбора трансфицированных клеток млекопитающих часто используют бактериальный ген Neo кодирующий неомицинфосфотрансфера-зу. В этой системе применяется токсичное соединение генетицин (G-418), блокирующее трансляцию в нетрансфицированных клетках млекопитающих. При этом в трансфицирован- [c.150]

Рис. 7.15. Двухвекторная система экспрессии. Клонированные гены (а и Р) кодируют субъединицы димерного белка ( Р). После одновременной трансфекции клетки двумя плазмидами в ней синтезируются обе субъединицы и собирается функциональный димерный белок. Оба вектора несут сайты инициации репликации, функционирующие в Е. oli (ori ) и в клетках млекопитающих (о/-/= ) маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. oli, эукариотический промотор (р) и сигнал полиаденилирования (ра), которые регулируют экспрессию селективного маркерного гена (СМ) и каждого из клонированных генов.

Рис. 7.16. Экспрессирующий вектор с двумя независимо транскрибируемыми генами. Клонированные гены (а и (3) кодируют субъединицы димерного белка (ар). Каждый ген встроен в вектор как часть отдельной единицы транскрипции и находится под контролем эукариотического промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра). Каждая субъединица транслируется со своей мРНК объединяясь, субъединицы образуют функциональный димерный белок (ар). Векторы содержат сайты инициации репликации, функционирующие в Е. соИ (оп ) и в клетках млекопитающих (р /сик) маркерный ген (Amp ) для отбора трансформированных клеток Е. oli, селективный маркерный ген (СМ), находящийся под контролем эукариотических промотора (р) и сигнала полиаденилирования (ра).

Внехромосомные экспрессирующие векторы млекопитающих обычно применяют для синтеза гетерологичных белков, использующихся в научных или медицинских целях. Они представляют собой челночные векторы с сайтами инициации репликации вируса животных и Е. со//-плазмиды. Регуляторные элементы транскрипции обычно происходят из генома вируса животных или из геномов млекопитающих. Для отбора трансфицированных клеток используют доминантные селективные маркерные гены. Некоторые системы отбора основаны на введении в среду возрастающего количества цитотоксичного соединения и позволяют получать клетки, содержащие большое число копий вектора, что увеличивает выход чужеродного белка. [c.155]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология