Библиотеки в фагах

Для скрининга библиотек на основе фага X можно использовать ДНК-зонды или иммунологические методы. Зоны лизиса (бляшки) переносят на фильтр и соответствующим образом тестируют. Если используется ДНК-гибридиза-ция, то вначале удаляют фаговые белки, затем ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. При тестировании иммунологическим методом белки, кодируемые клонированными генами. [c.74]

Помимо описанного выще, для случайного мутагенеза используют и другие методы, например один из вариантов олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза с применением ДНК фага М13. В этом случае затравкой для синтеза ДНК служит смесь олигонуклеотидов, содержащих случайные замены. В результате получают библиотеки клонов, несущих множество мутаций в различных сайтах. Недостаток подходов, при которых в клонированном гене образуется больщое число случайных мутаций, состоит в необходимости тестирования каждого клона для идентификации того, который детерминировал бы синтез нужного белка. Это весьма непростая [c.167]

Используемые при клонировании фаги X могут включать до 20 т. п. н. интегрированной чужеродной ДНК. С другой стороны, космиды (гибрид фага X с плазмидой) могут включать и переносить до 54 т. п. н. чужеродной ДНК. Что бы вы выбрали при создании библиотеки ДНК человека и почему Геном человека содержит около 3-10 нуклеотидных пар. [c.293]

Космидный вектор следует предпочесть вектору для клонирования на основе фага X, поскольку при использовании космид для полного перекрывания человеческого генома представительная библиотека должна включать меньшее количество клонов. Необходимое в каждом из случаев количество клонов можно рассчитать, как описано в приложении 9.2 [c.282]

Такой поиск осуществляют следующим образом. Библиотеку фагов X высевают на большую чашку Петри, так чтобы на чашке было приблизительно 10000 негативных колоний. Например, библиотека генома Drosophila melanogaster умещается всего на четырех таких чашках. Каждая негативная колония содержит химерные инфекционные фаги и большое количество химерных молекул фаговой ДНК, не уместившихся в головки фагов. Эта свободная ДНК дает возможность определить, какие именно из негативных колоний содержат интересующие нас [c.281]

Идею эпитопной библиотеки реализовали Дж. Скотт и Г. Смит в 1990 г. Они создали библиотеку фагов, у которых в ген III вслед за последовательностью, кодирующей сигнальный пептид рШ, в той же рамке трансляции были встроены сегменты ДНК, соответствующие всем возможным вариантам гексапептидов. Таким образом, индивидуальный фаг содержал в геноме одну из примерно 109 различных встроенных нуклеотидных последовательностей и представлял на вирионе соответствующий гексапептидный эпитоп в составе своих пяти молекул рШ. На N-конце зрелого белка рШ встроенный гексапептид был ограничен четырьмя аминокислотными остатками. [c.198]

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 т. п. н.), имеют большую ценность при анализе сложных эукариотических геномов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека или при идентификации отдельных генов. В отличие от библиотек с небольшими вставками, в геномной библиотеке с крупными вставками скорее всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которые нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в своем клоне. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 300 т. п. н. был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1 — химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой на основе фага Р1. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 т. п. н., на основе Р-плазмиды (F-фактора, или фактора фертильности) Е. соИ, которая представлена в клетке одной или двумя копиями, с селекционной системой la Z векторов pU . Эта конструк- [c.76]

При создании комбинаторных библиотек вместо фага X можно использовать нитевидные бактериофаги М13 или fd (рис. 10.14). В этих случаях соответствующий фрагмент антитела синтезируется как часть химерного белка, локализованного на поверхности фаговой частицы. Скрининг комбинаторной библиотеки фрагментов антител можно провести при помощи ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA). Суть метода состоит в следующем образцы (аликвоты) из библиотеки помещают в ячейки планшеты, содержащие антиген-мишень. Ячейки промывают, чтобы удалить несвязанные фаговые частицы. В каждую ячейку вносят конъюгат, состоящий из антитела, связывающегося с белком фаговой оболочки, и фермента. Ячейки промывают для удаления несвязанного конъюгата и добавляют в каждую из них хромогенный субстрат, который расщепляется ферментом, связанным с фагом, и окраши- [c.219]

Комбинаторная библиотека ( omhinatorial library) Библиотека, полученная встраиванием в вектор на основе фага I. кДНК легкой и тяжелой цепей различных антител - по одной комбинации в вектор. [c.550]

Е. соИ или фага Т4. ДНК-полимераза I обладает способностью удлинять цепь ДНК в направлении 5 3 путем присоединения комплементарного нуклеотида. Это свойство ДНК-полимераз используется в генной инженерии для построения второй комплементарной цепи при добавлении фермента к одноцепочечной ДНК-матрице в присутствии праймера произойдет ее удвоение. Это свойство используется, например, при создании кДНК-библиотек. ДНК-полимераза применяется также для заполнения бреши в цепи ДНК, например, при застраивании фрагментов с выступающими 5 -концами. Экзонуклеазная активность ДНК-полимераз используется для введения радиоактивной метки во фрагмент ДНК. [c.24]

На следующем этапе работы эту пленку помещают в раствор, содержащий так называемый зонд, т.е. одноцепочечные молекулы нуклеиновой кислоты, комплементарные отыскиваемым в библиотеке и содержащие радиоактивную метку. Таким радиоактивным зондом может служить информационная РНК, выделенная из ткани, в которой наиболее активно функционирует интересующий нас ген это может быть также искусственный дезоксиолигонуклеотид, синтезированный так, чтобы отвечать известной последовательности аминокислот в том белке, который кодируется разыскиваемым нами геном наконец, это может быть рестрикт из другого участка клонируемой ДНК. Радиоактивный зонд гибридизирует с комплементарной ДНК на поверхности пленки. Затем с пленки смывают не вступившие в гибридизацию остатки зонда и производят радиавтографию, позволяющую установить, где именно на поверхности пленки, а значит и на поверхности чашки Петри, располагаются негативные колонии, содержащие ДНК, способную гибридизировать с зондом (рис. 9.15). Затем из соответствующих негативных колоний можно выделить фаг, содержащий интересующий нас фрагмент чужеродной ДНК. [c.282]

Идеальный вектор для клонирования ДНК высших эукариот должен обладать как можно большей емкостью, чтобы можно было обойтись меньшим количеством циклов скрининга библиотеки для выделения клонированных перекрывающихся фрагментов крупного гена. В нынешнем поколении векторов наибольшей емкостью обладают космидные векторы, но используют их пока реже, чем векторы, полученные на основе фага %. Объясняется это частично непредсказуемостью поведения космидных векторов, а также существенно большей трудоемкостью методов получения космидных библиотек по сравнению с эквивалентными фаговыми библиотеками. В задачу данной главы входит описание ряда разработанных в нашей лаборатории методик, а также характерных случаев и наиболее распространенных ошибок, мешающих созданию полноценной библиотеки. Мы должны подчеркнуть, что техническая сложность проводимых экспериментов затрудняет детальный анализ всех аспектов космндного клонирования. Составленный нами свод методик должен рассматриваться лишь как руководство и допускает возможные отклонения. Однако следует иметь в виду, что не имеющие большого опыта исследователи не должны серьезно от них отклоняться до тех пор, пока не приобретут сами достаточного навыка, чтобы позволить себе импровизировать. [c.40]

Космидные векторы — плазмиды, несущие os-последователь-ности, распознаваемые компонентами системы упаковки фага X [1], представляют собой удобный инструмент для клонирования и анализа больших фрагментов геномов, картирования хромосом и клонирования генов, размер которых превышает 20 т. п. н. Хотя в настоящее время разработаны приемы, позволяющие конструировать космидные клоны и оперировать с космидными библиотеками, все же неизбел но возникают трудности при получении и анализе больших библиотек, необходимых для клонирования генома млекопитающих в частности, вызывает затруднение введение специфических модификаций во вставки в тех случаях, когда их нельзя прямо увязать с характеристиками рестрикционной карты. Эти трудности могут быть весьма существенными. Во многих случаях для их преодоления используются методы генетики бактерий, позволяющие упростить илп облегчить решение этих задач. [c.74]

Сортировка X- и Т-хромосом. В работе [333, 330] осуществлена препаративная проточная цитофотометрия X- и У-хромосом человека. Х-хромосома была выделена из клеточной линии с кариотипом 48,ХХХХ с помощью однолучевой сортировки. Этот материал был использован для приготовления библиотеки хромосомной ДНК после обработки рестриктазой ЕсоК1 и клонирования в фаге (см. разд. 2.3,2,2), У-хромосома отобрана с помощью двулучевого сортера из материала гибридной клеточной линии китайский хомячок X человек . Получение клеточных гибридов будет описано в разд, 3,4,3 в связи с локализацией генов в хромосомах. Важная особенность гибридных клеток человек х мышь или [c.132]

Чтобы выделить геномный клон р53, использовали библиотеки клонированных фрагментов тотальной ДНК мыши или человека. ДНК фрагментировали рестриктазами и встраивали в бактериофаг X, которым затем заражали бактерии. Образовывалось множество бляшек. С ними гибридизовали ДНК ранее полученных клонов и таким образом находили колонии фагов, содержащие ген р53. В результате были изолированы полные геномные копии гена р53 мыши и человека. Сравнение между собою геномных и кДНК клонов позволяет выяснить экзон-интронную структуру гена. Такая работа была проделана почти одновременно в ряде лабораторий, в том числе в нашей [c.43]

Библиотеки в Я-фагах конструируют аналогично космидным, но используемая для этого ДНК имеет размеры 15—20 т. п. н. Для удобства и большей эффективности мы отделяли плечи Я2001-вектора от остального материала, чтобы получаемые клоны высевать непосредственно из Q358. Используя упаковочную смесь Gigapa k, нам удалось получить 5хЮ рекомбинантов на 1 мкг вставочной ДНК- [c.36]

Рис. 5. Получение препаратов ДНК для прыжков по хромосоме путем частичного расщепления рестриктазой МЬо1. Показано влнянне увеличивающихся количеств фермента на размеры получаемых молекул ДНК. А — результаты, полученные при непосредственном нспользованин агарозных блоков с ДНК. 5-—препараты ДНК перед расщеплением рестриктазой МЬо1 подвергнуты пре-электрофорезу для удаления молекул ДНК малого размера. Небольшие молекулы ДНК мешают конструированию библиотек прыжков н эффективно удаляются на этой стадии. В обоих случаях включены маркеры размера, представляющие собой мультимеры фага Я (размер генома 48,5 т. п. н.).

Проведите пробную реакцию упаковки с 0,25 мкг лигирован-ного материала. Из-за больших количеств вектора, который надо лигировать для последующего создания геномной библиотеки (см. табл. 1), использовать коммерческие экстракты для упаковки нецелесообразно. Мы работаем со стандартным двухкомпонентным экстрактом [22]. Чтобы обеспечить эффективность упаковки, достаточную для создания полной геномной библиотеки прыжков по хромосоме , нужно иметь экстракты, осуществляющие контрольную упаковку ДНК фага дикого типа с эффективностью 3—4Х10 б. о. е./мкг ДНК. [c.109]

Векторы, основанные на использовании ДНК фага X или его os-сайта, имеют емкость до 22 (фаговые векторы и фазмиды) и даже 45 т.п.н. (космиды). Они практичны в работе, и поэтому их используют для создания геномных библиотек (см. гл. 9). Клонирование и анализ небольших фрагментов ДНК в них менее эффективны. [c.238]

Клонирование. Из данных табл. 9.1 видно, что для составления представительной геномной бибпиотеки необходимо собрать большое число клонов, достигающее для высших эукариот нескольких сотен тысяч и даже миллионов. Подчеркнем, что речь идет о клонах, содержащих рекДНК. Отсюда понятно, почему в системах клонирования, предназначенных для конструирования гаких библиотек, серьезное внимание уделяется проблеме прямой селекции подобных клонов. Ни один из методов не абсолютен. По этой причине стараются поставить, как минимум, два барьера против l Jтoнoв, не содержащих рекДНК. Одним из таких барьеров слу жит ограничение размера ДНК при ее упаковке в фаговые головки. Поэтому часто применяют векторы, сконструированные на базе ДНК фагов Л и Р1. [c.273]

Смотреть страницы где упоминается термин Библиотеки в фагах: [c.200] [c.115] [c.221] [c.470] [c.987] [c.42] [c.283] [c.287] [c.42] [c.58] [c.78] [c.89] [c.89] [c.91] [c.42] [c.136] [c.42] [c.287] [c.32] [c.32] [c.538] [c.209] [c.211] [c.211] [c.271] [c.277]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология