Иммобилизация трипсина

Иммобилизация протеолитических ферментов предотврагцает их автолиз (и также агрегацию) и позволяет проводить исследования даже в условиях, когда в случае свободных ферментов происходит быстрый автолиз. Примером является исследование термически индуцируемых конформационных переходов иммобилизованных а- и р-трипсинов при 20—75 °С [12]. [c.438]

Иммобилизация трипсина на целлюлозе. 10 мл 6%-ного раствора перйодата натрия смешивают с 0,5 г целлюлозы. Перемешивают смесь в течение 3 ч, затем осадок отделяют и промывают водой. Промытый осадок помещают в 10 мл 0,1 М трисового буфера, pH 8,0, содержащего 10 мМ СаС12 для уменьшения автолиза, и добавляют фермент. Количество добавляемого трипсина зависит от его удельной активности и, как правило, это 100 мг. Смесь инкубируют при перемешивании в течение 1—3 ч. Точное время инкубации устанавливают экспериментально, определяя удельную активность нативного трипсина и активность в супер-натанте для расчета количества фермента, связавшегося с но-сителем. Пробы для измерения активности супернатанта следует отбирать в процессе иммобилизации через каждые 20—30 мин. Полученный препарат иммобилизованного фермента отделяют фильтрованием, промывают буферным раствором и насыщенным раствором мочевины для удаления не связавшегося с носителем фермента. Высушенный на фильтре препарат иммобилизованного трипсина может храниться в течение нескольких месяцев при 4°С практически без потери активности. [c.148]

Эффективная активность лиганда под влиянием иммобилизации может меняться самым различным образом. На взаимодействие иммобилизованного лиганда с выделяемыми молекулами может оказывать значительное очень разнообразное влияние микроокружение, образуемое матрицей (плотность заряда, стерические препятствия и т. д.) оно же может также влиять и на структуру аффинного лиганда. Иммобилизация приводит также к изменениям в химической структуре, которые различным образом изменяют его молекулярные свойства. Так, например, существенную роль играет число связей между аффинным лигандом и нерастворимым носителем. Из сопоставления результатов, представленных на рис. 10,10,6 и в, следует, что неблагоприятное влияние возрастающего числа связей между молекулами соевого ингибитора трипсина и сефарозой 4В вызвано увеличением pH с 7,2 до 8,5 во время связывания белка после активации бромцианом. [c.274]

Природа полимерной матрицы. Полимерные гели, применяемые для иммобилизации, способствуют созданию оптимального микроокружения включенного фермента, что позволяет добиться высокой каталитической активности иммобилизованных препаратов. Оптимизация микроокружения достигается за счет подбора соответствующей гелеобразующей системы. Особенно удобными с этой точки зрения являются гели на основе сополимеров производных акриловой кислоты. Варьируя химическую природу исходных мономеров и их соотнощение, можно получать полимерные матрицы с наиболее подходящими для данной ферментативной реакции характеристиками. В частности, при введении в состав полимера мономерных звеньев, несущих электрический заряд, повышается каталитическая эффективность иммобилизованного препарата в реакциях с участием заряженных субстратов. Например, скорость реакции гидролиза положительно заряженного субстрата этилового эфира а-Ы-бен-зоил-/.-аргинина под действием трипсина, иммобилизованного в геле полиакриламида, возрастает при введении в полимерную цепь путем сополимеризации отрицательно заряженных мономерных звеньев акриловой кислоты. Увеличение скорости ферментативной реакции объясняется повышенным сродством положительно заряженного субстрата к отрицательно заряженной полимерной матрице. [c.66]

Так, связывание с поверхностью полиэтилентерефталата и фторсодержащих полимеров фермента трипсина увеличивает время тромбообразования (опыты на животных) до 3-6 месяцев [102]. Предложено связывать с синтетическими полимерами - полиэтилентерефталатом, полиамидами, полиуретанами, сщитым коллагеном, полигликолевой кислотой - такие ферменты, как стрептокиназа, урокиназа, а также плазмино-ген — предшественник фермента плазмина, способного расщеплять фибрин, и др. [103]. Положительные результаты дала совместная иммобилизация трипсина и гепарина [129]. [c.70]

Иммобилизация трипсина на триазинактивированной трубке. Активированную трубку Va или V6 длиной 100 см, содержащую дихлоро-сылел-триазиновые группы, обрабатывают раствором трипсина (5 мг) в фосфатном буфере (pH 7,0, 1 = = 0,15) (5 мл). Циркуляцию раствора фермента продолжают в течение 3 мин, затем реакцию иммобилизации останавливают путем добавления 1,0 М аммиачного раствора NH4 I (pH 9,2 [c.32]

Иммобилизация предварительно модифицированных ферментов. При адсорбционной иммобилизации на ионообменниках часто возникают затруднения, связанные с тем. что для многих ферментов изоэлектрическая точка и рН-оптимум каталитической активности очень близки. Поэтому прочная сорбция наблюдается лишь в областях pH, далеких от изоэлектрической точки, где каталитическая активность мала. Чтобы преодолеть это препятствие, был разработан метод иммобилизации, ферментов, предварительно модифицированных введением ионогенных групп (поликислоты, карбоксиметилцел-люлоза, остатки янтарной кислоты и т. п.). Например, при модификации а-химо-трипсина хлортриазиновым красителем (активным ярко-оранжевым КХ) изоэлектрическая точка фермента сдвигается в щелочную область. В результате этого модифицированный а-химо-трипсин достаточно хорошо сорбируется на многих ионообменниках с сохранением [c.54]

Впервые этот способ был использован П. Берифельдом и Дж. Уэном (1963), которые осуществляли иммобилизацию ряда ферментов (таких, как трипсин, рибонуклеаза и р-амилаза) в геле, полученном радикальной полимеризацией Ы,Ы -метилен-бис-ак-риламида. [c.58]

Иммобилизация позволила также механическим путем регулировать. каталитическую активность иммобилизованных ферментов [3]. Иммобилизованный трипсин на эластичном носителе, как, например, на найлоне, уменьшает ферментативную активность при растягивании носителя — найлонового волокна. Причина этого может состоять в деформадии молекул белка. Из-за небольшого объема молекул фермента такие механохимические исследования трудно осуществить другим путем без иммобилизации. [c.438]

Однако -нитрофенильную группу удалось заместить только на L-фенилаланин-п-нитроанилид или -лейцин-п-нитроанилид. Амидные связи в боковой цепи, которые образуются за счет специфической -аминокислоты, могут быть разрушены с помош,ью химо-трипсина как in vivo, так и in vitro. Платэ и Валуев [136] описали синтез афинных адсорбентов для биоспецифической хроматографии. Химическими методами осуществляется иммобилизация полимерных носителей путем связывания специфических лигандов с матрицей. После активации бромцианом протеин может быть связан с имидокарбонильной группой [c.101]

Отечественный медицинский материал некролитического действия Дальцекс-трипсин , представляющий собой медицинскую марлю с привитым ферментом трипсином, способствует очищению гнойно-некротических тканей, уменьшает количество патогенной микрофлоры, снимает воспалительную реакцию [28]. Полиферментные салфетки для перевязок гнойных ран получают иммобилизацией на медицинской хлопчатобумажной марле смеси ферментов трипсина и лизоцима [29]. [c.191]

Таким образом, с точки зрения возможностей ковалентной иммобилизации ферментов белковые молекулы удобно представить в виде своеобразных шариков с экспонированными наружу функциональными группами тиольными (цистеина), гидроксильными (алифатическими — серина и треонина, ароматическими — тирозина), карбоксильными (глутаминовой и аспарагиновой кислот, а также С-концевыми), гуанидиновыми (аргинина), имида-зольными (гистидина) и аминогруппами (е-лизина и а-, Л/ -кон-цевыми). Оценку количества тех или иных групп в различных белках в первом приближении можно сделать по данным, приведенным на рис. 13. Например, в таком небольшом белке, как трипсин или химотрипсин, с молекулярной массой около 25 ООО, должно быть до 10 остатков цистеина, около 30 алифатических ОН-групп, 3—7 остатков тирозина, 7—12 остатков аргинина, свыше Ю аминогрупп и 40 карбоксильных групп. Результаты такой оценки соответствуют известным экспериментальным данным. [c.84]

Хорошо известно, что протеиназы, расщепляя денатурированные белки, способствуют очищению ран, и следовательно, их заживлению. В этом направлении, в клинической практике с помощью иммобилизованных протеиназ сделано многое. В качестве носителей для иммобилизации протеолитических ферментов наиболее употребимы волокнистые материалы на основе целлюлозы, поливинилового спирта, солей альгиновой кислоты, полиамидное и коллагеновое волокно. Готовят препараты, иммобилизованные также на гранулированных материалах — целлюлозных шариках, гранулах декстрана, предварительно гидролизованных шариках капрона. Применяют также препараты, изготовленные нековалентным включением фермента в растворимые целлюлозы, в медленно рассасывающийся коллаген. Готовят нити, в которые при формовании включают фермент и используют их в качестве шовного материала. Сравнительный анализ действия нативных и иммобилизованных протеиназ (в основном а-химотрипсина, трипсина, террилитина, субтилизи-на, коллагеназы) показал, что уже на 2—4-й день рана очищается от некротических масс и по крайней мере вдвое быстрее наступает грануляция. [c.132]

Используя методы, описанные в гл. 1, готовят адсорбент путем иммобилизации ингибитора трипсина из соевых бобов на СЫВг-активированной сефарозе 4В. [c.122]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология