Агароза для методов преципитации в гел

Приведенные примеры ясно показывают, что тонкослойная гель-фильтрация в сочетании с иммунной преципитацией является простым и удобным методом, который может дополнить иммуноэлектрофорез при идентификации белков в биологических жидкостях или при выделении белков. В случае необходимости чувствительность и разрешение метода можно повысить, выполняя электрофорез после тонкослойной гель-фильтрации в геле агарозы, содержащем антитела. [c.275]

В данных методах совмещены электрофоретическая миграция антигенов в агарозе с последующей иммунопреципитацией в геле. В результате первого процесса происходит частичное разделение смеси антигенов, поскольку скорость их миграции в геле зависит от суммарного заряда при данном рП буферного раствора. Кроме того, отрицательно заряженные молекулы быстро мигрируют в гель, содержащий антитела, что ускоряет преципитацию и сводит к минимуму латеральную диффузию. [c.215]

С этой точки зрения вряд ли имеет смысл использовать для контроля за развитием иммунного ответа и описанные ниже методы, основанные на диффузии и преципитации иммунных комплексов в гелях агарозы или агара, хотя это и встречается нередко в научной литературе. Чувствительность диффузионных методов того же порядка, что и для преципитации в жидкости. Возможность окрашивания преципитатов в геле дает относя-тельно небольшой выигрыш в чувствительности, поскольку лимитирующим фактором является образование пространственной сетки преципитата. Вместе с тем, все диффузионные методы требуют много времени. [c.124]

На стыке гелей ПААГ и агарозы в силу заметного различия степени эндосмоса может иметь место смазывание линий иммунопреципитации и искажение ее картины, поэтому используют специальный метод наложения полосы ПААГ на гель агарозы. Последний формируют из двух частей. У края пластины, который впоследствии будет обращен к катоду, заливают слой геля агарозы без антисыворотки с таким расчетом, чтобы он был на несколько миллиметров шире, чем полоса ПААГ, которую предстоит уложить на этот слой вровень с наружным его краем. Вплотную к пустому слою агарозы на остальной площади пластины слоем такой же толщины формируют гель агарозы в смеси с антисывороткой. Линия раздела двух слоев должна быть параллельна катодному краю пластины и ориентированной по нему полосе ПААГ. Переносить и накладывать эту последнюю на гель агарозы удобно с помощью упомянутой выше тонкой металлической пластинки. Перед наложением пластинку следует повернуть полосой геля к себе, а затем перевернуть гелем вниз и таким образом уложить его на поверхность агарозы. Электродные фитили накладывают на наружный край полосы ПААГ (катодный) и на противоположный край пластины геля агарозы. В ходе электрофореза во втором направлении антигены из ПААГ переходят в гель агарозы и далее мигрируют в ней, образуя пики преципитации. Различие степени эндосмоса в этом случае никаких проблем не создает. [c.151]

Носителями в данном случае чаще всего служат ацетат целлюлозы [26] и гели агарозы [4]. Разрешающая способность таких систем очень низка из-за чрезмерного диффузионного размывания зон. Применение в качестве носителя крахмального или полиакриламидного геля значительно повышает разрешающую способность прежде всего благодаря молекулярно-ситовому эффекту. Иммуноэлектрофорез [56] является одной из разновидностей зонного электрофореза при постоянном значении pH после разделения белки диффундируют навстречу специфическим антителам и их взаимодействие приводит к образованию дуг иммунопреципитации. Полуколичественную оценку каждого антигенного компонента можно выполнить методом электроиммунодиффузии [57]. После разделения методом зонного электрофореза антигенные белки электрофоретически мигрируют в направлении, перпендикулярном прежнему пути, в гель, содержащий равномерно распределенные антитела. Высота образующихся пиков преципитации является мерой относительной концентрации белков в смеси. [c.120]

Большинство преципитирующих антител относится к классу иммуноглобулинов О (1дО), обладающих лишь очень слабым отрицательным зарядом при pH 8—9. Поэтому электроосмоти-ческий поток смещает 1 0 к катоду. Электроэндосмос заметно уменьшается при замене агара агарозой. Путем подбора определенных соотношений агара и агарозы можно регулировать скорость эндосмоса, создавая тем самым оптимальные условия для электросинереза. Очевидно, что антитела следует помещать ближе к аноду, а антиген — ближе к катоду. Если расположить рядом несколько лунок с антигенами, то последние можно сравнивать между собой подобно тому, как это делается в методе двойной иммунодиффузии [186]. Видимые линии преципитации образуются в течение 1—2 ч. Избыток реагентов удаляют, продолжая электрофорез после образования преципитатов. При этом нет надобности отмывать гель перед окрашиванием, что позволяет в течение 3—4 ч получить полную картину окрашенных полос преципитации. [c.247]

Реакция преципитации в геле Преиипитац11я комплекса антиг ен-антитело непосредственно в инертном геле (как правило, агаре или агарозе) нашла широкое применение для анализа антигенов. Совреме1шые модификации метода основаны на том, что взаимодействие антигена и антитела происходит непосредственно в толще геля, куда реагирующие соединения поступают за [c.253]

Метод Ухтерлони проверяют антнсыворотку по отношению к иммуногену, стандартному антигену, смеси антигенов, родственным белкам и т. п. ИЭФ проверяют антисыворотку к разным антигенам, как в методе Ухтерлони (рис. 2.10). Двумерный ИЭФ аитисыворотка в агарозе реагирует со смесью антигенов, выбирают сыворотку, дающую один пик преципитации (рис. 2.2,5). ПГА, ЕЫЗА/ИРМА используют нагруженные антигеном эритроциты нлн лунки с адсорбированным антигеном (рис. 2.9). [c.94]

На строго горизонтальную поверхность пластины ПААГ быстро выливают расплавленный 0,5%-ный раствор агарозы в СФБ, чтобы получить слой толщиной 1 мм. Предварительно агарозу смешивают при 56° с разбавленной специфической антисывороткой. После застывания геля агарозы такую двуслойную пластину выдерживают при 37° во влажной камере 2—6 ч, в зависимости от размера молекул антигена, диффундирующих из ПААГ в агарозу. Затем, отметив на пленке агарозы положение лидирующего красителя в рабочем ПААГ, ее снимают, покачивая пластинку в СФБ. Пленка агарозного геля легко отделяется от ПААГ. Одновременно с диффузией в гель агарозы идет им-мунохимическая реакция антигенов с находящимися в геле антителами и образование преципитатов. Пленку вымачивают в течение 4 ч в том же буфере, удаляя из нее не прореагировавшие иммуноглобулины антисыворотки и белки неантигенной природы, перешедшие туда из ПААГ. Преципитировавшие иммунные комплексы с участием искомого антигена можно окрасить обычными способами или обнаружить методом авторадиографии, если антиген или антитела несут радиоактивную метку. Отметим, что преципитация здесь требует подбора концентраций и довольно значительного времени диффузии антигенов в агарозу для обеспечения эквивалентного соотношения концентраций антител и антигена. [c.129]

Для разделения антигенов вместо электрофореза можно воспользоваться ИЭФ. Такая замена описана еще в 1978 г. [Weiss et al., 1978]. В то время еще не выпускалась агароза со слабой способностью к эндосмосу, пригодная для ИЭФ. Авторы были вынуждены воспользоваться 4%-ным ПААГ, что приводило к значительному увеличению продолжительности иммунодиффузии (до 3 сут). Использование названных в части I специальных марок агарозы для ИЭФ делает иммуноэлектрофокусирование столь же доступным методом, как иммуноэлектрофорез. Впрочем, высокая разрешающая способность ИЭФ имеет в этом случае и оборотную сторону. Независимо от формы лунки белки будут фокусироваться в виде узких полос, поэтому дуги преципитации будут, очевидно, иметь менее удобную для расшифровки форму. [c.139]

Прауз и соавторы предложили микромодификацию метода Лорелла. Весь процесс переносят в капилляры диаметром около I мм. Агарозу с антисывороткой полимеризуют в капилляре, а раствор антигена наносят на торец столбика геля, как при обычном электрофорезе в трубках. Опыт ведут в стандартном приборе для вертикального электрофореза. Здесь, разумеется, не образуется никаких ракет , поскольку поперечная диффузия антигена отсутствует, и это повышает чувствительность метода. Измеряют расстояние плоского фронта преципитации от начала геля после прекращения продвижения этого фронта, вдоль трубки в связи с исчерпанием антигена. Столбики гелей из серии капилляров выдавливают водой на покрытую агарозой пластинку, выравнивают их там по сетке подложенного снизу трафарета и закрепляют несколькими каплями расплавленной агарозы. В таком виде все столбики геля одновременно окрашивают. Удается обнаружить до 10 мкг белка-антигена при объемной концентрации неразбавленной антисыворотки в агарозе около 0,1%. [c.143]

Этот метод количественного двумерного, или, как его чаще называют, перекрестного иммунозлектрофореза является комбинацией рассмотренных выше методов [ larke, Freeman, 1967]. Сначала в первом направлении смесь белков-антигенов разделяют обычным электрофорезом в агарозе (или ПААГ). Затем следует электрофоретическая миграция разделившихся антигенов в перпендикулярном (втором) направлении. Миграция идет в геле агарозы, смешанной с полифункциональной антисывороткой против исходной смеси антигенов. Каждый белок-антиген во втором направлении мигрирует независимо от других и образует зоны преципитации, подобные ракетам Лорелла , но более широкие у основания и напоминающие обычные хроматографические пики. Эта форма пиков обусловлена тем, что миграция начинается не из резко очерченной лунки, заполненной одинаковым по всему ее объему раствором антигена, а из более или менее размытой белковой зоны, образовавшейся в результате электрофореза в первом направлении. [c.144]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология