Сыворотки, получение моноклональных антител

Как уже отмечалось в гл. 3, получение мышиных моноклональных антител можно наладить в любой лаборатории, где имеются соответствующие линии животных и условия для работы с культурами клеток и тканей. По сравнению с этим возможность получения моноклональных антител (МКА) человека остается проблематичной. Поэтому ответим сначала на вопрос для каких исследований нужны именно такие МКА Можно сразу же выделить две большие области, где они необходимы. Во-первых, это изучение антигенных систем человека. Для этого необходимы антитела очень тонкой специфичности, способные распознавать аллоантигены. Такие антитела нельзя получить ксеноиммунизацией неприматов, например грызунов, антигенами человека, в частности принадлежащими к столь полиморфной системе, как продукты главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса П. Несмотря на многочисленные попытки получения МКА грызунов к антигенам МНС класса И человека, до сих пор никто не располагает препаратами, способными дифференцировать частные специфичности этих антигенов, что необходимо для серотипирования тканей. Ксеноим-мунные антитела не позволяют выявлять и аллельные варианты антигена D в резус-системе человека. В настоящее время для определения этого антигена и для иммунотерапии гемолитической анемии новорожденных ( голубые младенцы ) применяют исключительно сыворотку человека, полученную из крови соответствующих доноров. [c.153]

Используя специфические связывающие свойства антител, исследователь может выбирать между двумя различными формами реагента, приготовленного на их основе это обычные поликлональные антисыворотки (или иммуноглобулиновые фракции, полученные из сыворотки) и моноклональные антитела (МКА). Препараты и тех, и других получают различными путями с различной целью выбор между ними осуществляется зачастую не произвольно, а в большой степени зависит от соответствия специфических свойств антител требованиям теста. [c.21]

IV. Антисыворотки к иммуноглобулинам мыши и крысы. Для общих целей анти-IgG, получают путем иммунизации животных фракцией IgG, полученной в результате аффинной очистки на колонке с протеинА-сефарозой (разд. 10.6.1). Для удаления антител к другим классам иммуноглобулинов сыворотки сорбируют моноклональными антителами или сывороткой, лишенной IgG. [c.104]

Получение моноклональных антител (МкАТ). Вводимый или попадающий в организм антиген признается и перерабатывается макрофагами, затем антигенная информация представляется лимфоцитам, содержащим рецепторы. Так, в частности, стимулируется формирование клонов плазматических клеток, продуцирующих специфичные антитела. Качество и количество антител зависят от качества и дозы антигена, способа его введения в организм, от вида животного — реципиента. Однако при традиционной технологии удается получать преимущественно гетерогенные антитела. В то же время "жизнь диктовала" необходимость получения моноклональных антител — продуктов единого клона клеток. Важным шагом к этому было открытие Портера в 1972 г., связанное с установлением "антительной природы" парапротеинов в сыворотке крови людей и животных с опухолевым поражением лимфатической системы (миелома). Миеломные клетки представляют собой трансформантов плазматической клетки, продуцирующих моноклональные антитела. К сожалению, антиген при этом до сих пор остается неустановленным. Тем не менее, факт образования моноклональных антител миеломными клетками был решающим в создании гибридом, с помощью которых сделан огромный скачок в иммунобиотехнологии. Выдающийся вклад в это внесли Г. Келер и К. Милстейн (1975), разработавшие метод получения МкАТ желаемой специфичности и в большом количестве. [c.570]

Основной принцип ELISA — специфическое связывание первого антитела с мишенью. Если молекула-мишень представляет собой белок, то его очищенный препарат обычно используют для получения антител, при помощи которых затем и выявляют данную мишень. Антитела, которые образуются в сыворотке (антисыворотке) крови иммунизированного животного (обычно кролика), связываются с разными антигенными детерминантами (эпитопами) моле-кулы-мишени. Такую смесь антител называют поликлональным препаратом. Использование поликлональных антител имеет два недостатка, существенных для некоторых методов диагностики 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить две сходные мишени, т. е. когда патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой. Однако эти проблемы вполне разрешимы, поскольку сейчас научились получать препараты антител, выработанных к одной антигенной детерминанте, т. е. препараты моноклональных антител. [c.184]

Линия гибридомных клеток не истинно нейрональная модельная система, однако она должна быть упомянута здесь, поскольку представляет собой полезный инструмент исследования в нейрохимии. Каждый В-лимфоцит обычно секретирует только один тип антител. Смесь большого числа моноспецифических антител образует нормальную гетерогенную антисыворотку. Для получения высокопродуктивных моноспецифических лимфоцитов, секретирующих антитела, Кёлер и Милштейн проводили слияние В-клеток иммунной мыши с опухолевыми клетками. В отличие от нормальных лимфоцитов, полученные гибридные клетки растут и размножаются практически бесконечно и продуцируют смесь антител против антигена, используемого для иммунизации. Даже если антиген является индивидуальным белком, продуцируемые антитела представляют собой смесь многих антител, каждое из которых направлено против одного специфичного антигенного участка исходной молекулы. Для получения моноспецифической сыворотки, т. е. раствора антител против одной антигенной области и происходящих из одного вида гибридомных клеток, эти клетки необходимо отобрать и клонировать . Теперь клон продуцирует моноклональные антитела , гомогенную популяцию антител против только одной детерминанты антигена. Эти моноклональные антитела можно пспользовать для разнообразных исследований, например для идентификации функциональных участков молекулы. Но что еще более важно, такой метод может использоваться для полу- [c.371]

Трудности, с которыми можно столкнуться при наработке моноклональных антител, связаны с получением достаточного количества иммуногена и последующим скринингом сыворотки для выявления нужной иммунологической активности. Использование гиперэкспрессии гибридных белков может облегчить преодоление этих трудностей, поскольку дает возможность выделять большие количества белкового продукта с помощью электрофореза или хроматографии. При скрининге сыворотки и полученных затем гибридных клонов можно применять метод радноиммунного анализа (РИА, RTA) или метод твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). [c.173]

Другим способом получения индивидуальных антител определенной специфичности служит гибридомная технология — создание иммортали-зованной (бессмертной) линии клеток, продуцирующих антитела только одной специфичности, Т. е. моноклональные (рис. 29.16). В такой культуре можно поддерживать антителообразование неопределенно долгое время. Моноклональные антитела несравнимо лучше соответствуют целям иммуноанализа, чем гетерогенные сыворотки, получаемые от иммунных животных, и поэтому нашли широкое применение в различных областях биологии в качестве высокоспецифичных зондов. [c.537]

Бессыворбточиые среды. В настоящее время наблюдается тенденция к производству моноклональных антител в средах с низким содержанием сыворотки или в бессывороточных средах, хотя публикаций о применении таких сред в промышленном масштабе очень немного. Преимущества таких сред по сравнению с обычными, содержащими 10 и более процентов сыворотки, заключаются в упрощении процесса и удешевлении продукции. В случае бессывороточных сред, кроме того, достигается более высокая воспроизводимость процесса, поскольку каждый компонент среды хорошо известен и может быть получен в очень чистом состоянии. HaKonen, бессывороточные синтетические среды полезны и в научно-исследовательских работах, поскольку в них можно селективно варьиромть концентрацию любого компонента. По сути дела, для проведения корректных научных исследований по росту гибридомных и других клеточных линий в первую очередь необходимо иметь хорошо охарактеризованную бессывороточную среду. [c.42]

Описанный выше метод применяется для разделения экст-рапированных бактериальных и паразитарных антигенов, а также компонентов сыворотки человека. Он позволяет получать хорошие полосы бел ков с мол. массой от 150 до 10 кДа. Для ограничения этого диапазона можно изменить концентрации акриламида. Известны наборы для приготовления минигелей см. приложение). В них. входят специальные кассеты для заливки гелей. Они более экономичны с точки зрения расхода реагентов и требуют меньше времени, но одновременно снижается разрешающая способность при разделении очень сложных смесей. Компромисс состоит в использовании мини-гелей с различными концентрациями акриламида. Рис. 2.4 иллюстрирует разрешающую способность 14%-ного геля шириной 14 см при разделении экстрагированных из мембран и разрушенных белков Е. oli и микобактерий. Последние служат исходным материалом для получения как моноклональных антител, так и кроличьей полиспецифической антисыворотки. Белки Е. соИ получают следующим образом [27]. [c.62]

Антисыворотки к подклассам IgA и IgG могут быть получены с помощью гибридомной технологии. Готовые к применению аффинно очищенные антитела могут быть использованы как в качестве им муногенов, так и в качестве сорбирующих антигенов. При этом простота в определении изотипов моноклональных антител сочетается с возможностью успешного получения специфической преципитирующей антисыворотки. Сыворотки получают, вводя животному интактные молекулы Ig илн F -фрарменты, затем их истощают на колонках со смесью других изотипов, содержащих как х-, так и Я-цепи. Получение чистого IgGaa мыши для иммунизации и адсорбции может быть осуществлено физико-химическими методами (разд. 10.6.1). [c.104]

При использовании сыворотки крови от больных с опухолями или моноклональных антител, полученных к опухолевым клеткам от таких больных, обычно выявляются антигены, широко представленные на поверхности или чаще внутри как опухолевых, так и нормальных клеток. Соответствующие антитела большей частью принадлежат к классу IgM и, следовательно, обладают низкой аффинностью. Аналогичные моноклональные антитела могут быть получены с использованием иммортализованных В-клеток от здоровых индивидов. Такие антитела выявляют аутоантигены, и роль их в иммунном ответе организма на опухоль (если он существует) неясна. [c.380]

Иммунологические методы. Эти методы применяют для выявления определенных клонов с рекДНК, если клонируемые гены экспрессируются. Напомним, что молекулы белков имеют по несколько антигенных детерминант (эпитопов), на каждый из которых в организме животных вырабатывается свое антитело (специфический иммуноглобулин). Сыворотки, получаемые стандартными методами, поликлональны, т. е. содержат антитела ко многим эпитопам данного белка. Возможно получение и моноклональных антител, если использовать гибридомы (см. рис. 5.8). Хотя моноклональные антитела при скрининге дают небольшой фон ошибочных положительных ответов, используют обычно поликлональные антитела. Это связано с тем, что детектируемым белок может иметь в чем-то измененную структуру или присутствовать в виде фрагмента. [c.283]

Исследование изолированных полипептидных цепей иммуноглобулинов и реконструированных из них молекул указывает на то, что большинство идиотипических детерминант образовано при участии как легкой, так и тяжелой цепи. В частности, установлено, что изолированные легкие цепи миеломного иммуноглобулина не реагируют с антителами, полученными против идиотипических детерминант целой молекулы белка. При реконструкции молекулы из изолированных цепей структура идиотипических детерминант восстанавливалась только в том случае, если легкие и тяжелые цепи принадлежали иммуноглобулину, который служил антигеном при получении антиидиотипической сыворотки. Последнее не удивительно в свете уже обсуждавшейся в разделе 3.3 работы К. Доррингтона, в которой было показано, что при реконструкции молекулы иммуноглобулина из легких и тяжелых цепей, взятых из разных молекул (разных моноклональных иммуноглобулинов), связывание легкой цепи идет за счет ее константного домена, а вариабельные домены легкой и тяжелой цепей не взаимодействуют между собой. [c.89]

Одновременную инкубацию обоих конкурентов (меченого и немеченного миозина) с первичными антителами использовали Кларк и соавторы для отбора моноклональных гибридбм — продуцентов антител против миозина. Роль иммунной сыворотки в этих опытах каждый раз играли среды культивирования различных гибридом, полученных в результате слияния клеток селезенки крыс и мышей, иммунизированных миозином, и клеток миеломной линии P3-X63-Ag8. Инкубацию проводили в боратном буфере (pH 8,4), содержащем 40 мМ пирофосфата натрия, по 1% Тритона Х-100 и дезоксихолата, а также 2% нормальной сыворотки крысы или мыши. Эту сыворотку вводили опять-таки ради создания эквивалентного соотношения концентраций при последующем добавлении вторичных антител в составе анти сыворотки козы против иммуноглобулинов крысы или мыши Использовав для конкуренции миозин гомологичного и гетеро логичного происхождения, авторы выясняли степень специфич ности антител, синтезируемых гибридомами [ lark et al., 1980] [c.282]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология