Ферменты идентификация функциональных

Мы начали эту часть, решив попытаться выяснить механизм действия ферментов как проблему механизма любой другой органической реакции. Каталитические механизмы, используемые ферментами, можно, безусловно, рассматривать в терминах взаимодействия небольшого числа функциональных групп внутри фермент-субстратного комплекса. Однако немалую трудность представляет выяснение того, какие именно группы фермента участвуют в катализе. Белок содержит множество функциональных групп, избирательно реагирующих с большинством реагентов. Для того, чтобы специфически затронуть группы активного центра, можно полагаться только на реакции с субстратами. Поэтому первым важным шагом в изучении специфической ферментативной реакции является идентификация функциональных групп, вовлеченных в каталитический механизм. [c.477]

Все это в известной степени затрудняет точную идентификацию функциональных групп ферментов, участвующих в механизме катализа, по величинам рК, определяемым из данных ферментативной кинетики. [c.112]

Итак, анализ зависимостей скорости от pH является весьма эффективным средством идентификации функциональных групп белковой молекулы фермента, участвующих в процессе активации молекул субстрата. Зная природу активных центров, можно представить себе, как они работают. Конечно, при этом приходится пользоваться теми же представлениями о механизме элементарных актов, которые сложились при изучении обычных реакций органической химии. Вводить какие-то особые механизмы нет никакой необходимости. Существует твердое убеждение в том, что работа фермента сводится в конечном счете к совокупности простых операций, аналогичных тем, которые совершаются при взаимодействии органических молекул в обычных пробирочных условиях. [c.100]

С 1960-х годов и особенно в 80-е годы для проведений фундаментальных исследований по растительным белкам вер больше используются специфические антитела. Иммунохимические методы использовались при изучении белков с различными функциональными свойствами, таких, как ферменты, изо-ферментные компоненты, ингибиторы протеаз, лектины, запасные белки. Эти методы применялись при решении задач идентификации белков, определения их содержания, очистки, локализации в тканях, клетках и клеточных структурах, а также энзиматической регуляции. Они использовались в исследованиях по физиологии, патологии, биохимии, генетике и молекулярной биологии растений. Очень многие работы в этой области нашли отражение во множестве обзорных статей [12, 21—23, 26, 29, 35, 50, 57, 79, 83, 96]. [c.112]

Идентификация аминокислотных остатков, входящих в активный центр того или иного фермента, осуществляется различными методами. Так, применение ингибиторного анализа дает возможность выявить функциональные группы, отвечающие за проявление ферментативной активности. Локализация активного центра возможна также при применении протеолитических ферментов, гидролизующих молекулу фермента на отдельные фрагменты. [c.65]

Некоторые удобные формы графического представления зависимости Кт, V и У/Кт от pH, необходимые для идентификации каталитически важных функциональных групп ферментов, будут рассмотрены в гл. XIV. [c.90]

Рнс. 38. Влвянне pH среды на ак- ментативной реакции играют важную роль в тивность ферментов идентификации функциональных групп фермен- [c.98]

Эксперименты по фиксации интермедиатов являются, таким образом, весьма мощным приемом в работе по изучению механизмов действия ферментов, и борогидрид был использован в ряде случаев для регистрации таких интермедиатов. Мы не можем, однако, ожидать, что неспецифичный реагент обычно будет способен вмешиваться в химию процессов фермент-субстратного комплекса. Борогидрид — особый случай, так как это очень маленькая молекула, почти такого же размера и формы, как Н2О. Ферменты обычно способны оставлять посторонние молекулы вне активного центра. Наилучший способ поместить реагент в активный центр — это замаскировать его под субстрат, т. е. использовать аналог субстрата, располагающий структурными особенностями, необходимыми для связывания, но несущий также функциональную группу, предназначенную для необратимой реакции с группами активного центра. (Поэтому такие реагенты пригодны больше для идентификации функциональных групп активного центра, чем для регистрации интермедиатов.) Далее мы детально опищем подход с применением аналогов субстратов, используя некоторые из многочисленных примеров, доступных из работ по химотрипсину. [c.481]

Наиболее эффективный метод идентификации функциональных групп актианого центра — реитгеноструктурный анализ. На осноае информации о пространственной структуре фермент-субстратиого комплекса, взаиморасположении каталитических групп фермента и атакуемой саязи субстрата а ряде случаев удается расшифровать механизм действия фермента. [c.187]

В настояш,ее время ингибиторный анализ ферментов является не только методом качественной идентификации функциональных групп, имеющ,их отношение к каталитической активности. Он находит все большее применение для количественной оценки реак-ционноспособности, выяснения особенностей строения активных центров. Появление в последние годы полифункциональных ингибиторов позволяет выявить взаимное расположение функциональных групп в активных центрах, т. е. подойти к расшифровке уникальной мозаики трехмерного строения ферментов, определяющей их субстратную специфичность. [c.79]

Следует напомнить об известных трудностях идентификации функциональных групп активных центров ферментов по величинам рК, полученным из изучения зависимости скорости реакции от pH. Во-первых, одна и та же группировка в белках разного строения может иметь неодинаковое значение рК из-за влияния соседних групп. Некоторую помощь в этом случае может оказать измерение теплоты диссоциации ионогенных групп, рассчитываемой по измерениям температурной зависимости рК. К сожалению, для холинэстераз эти термодинамические константы достаточно надежно не измерены. Согласно данным Шукудза и Шинода [122], теплоты диссоциации основной группировки ацетилхолинэстеразы эритроцитов и холинэстеразы сыворотки крови человека составляют соответственно 8,5 и 6,5 ккал1моль. Эти величины выше или ниже найденной для диссоциации имидазольной группы гистидина в других белках (6,9—7,5 ккал моль [123]). Если признать, что в обеих холинэсте-разах в качестве основной группировки активного центра выступает имидазол гистидина, то трудно понять столь существенное различие в величинах теплот диссоциации. Во-вторых, даже если измерение активности фермента при разных pH рассматривать в качестве своеобразного титрования функциональных групп активного центра, то полученные результаты нельзя безапелляционно считать отражением прямого участия этих групп в каталитическом акте. Можно представить, что ионы Н и ОН -среды выполняют свою функцию, вызывая не только протонизацию или депротонизацию функциональных групп активного центра, но также и более общую функцию создания и поддержания специфической для каждого фермента третичной структуры. Можно думать, что в создании третичной структуры фермента большую роль играют ионные связи между такими группировками, которые расположены вне активного центра и непосредственно не участвуют в реакции с субстратом. Такие ионогенные группировки при взаимодействии могут сближать друг с другом (или наоборот удалять друг от друга) определенные функциональные группы белка, которые непосредственно участвуют в каталитическом акте. Внешне эта непрямая роль кислотно-основных группировок фермента будет отражаться в форме обычной зависимости кинетических констант (и, V, Кт) от pH, но по существу такая зависимость не дает оснований для решения вопроса, является ли она следствием влияния pH на конформацию белка в районе активного центра или диссоциацию группировки, прямо участвующей в реакции с субстратами. [c.184]

Проблемы торможения ферментов имеют огромное практическое и теоретическое значение. Ингибиторы играют решающую роль при изучении механизма ферментативных реакций, при идентификации функциональных групп фермента. Существуют соединения, которые специфически связывают определенные группы в молекуле фермента (см. раздел Активный центр ферментов ). Если в результате действия таю1х реагентов заметно нарушается ход ферментативной реакции, то можно сделать некоторые заключения о характере групп, входящих в активный центр фермента. [c.232]

Идентификация функциональных групп активного центра аденилатциклазы до сих пор фактически не проводилась. Необратимое ингибирование аденилатциклазы было показано только с помощью неспецифических реагентов, модифицирующих аргинин,— 2,3-бутандиона и фенилглиоксаля [165, 166]. Доказательством расположения модифицируемой группы в активном центре служила защита фермента от инактивации субстратом аденилатциклазы. [c.117]

Методом рентгеноструктурного анализа было исследовано большое число кристаллических ферментов. Результаты таких исследований часто сопоставляются с данными, полученными химическими методами при 1) определении аминокислотной последовательности ферментов, 2) изучении их субстратной специфичности, 3) исследовании действия специфических ингибиторов и 4) идентификации специфических функциональных групп в активном центре. С целью выявления возможной связи между каталитическим действием ферментов и их третичной структурой были изучены представители большинства основньгх классов ферментов (см. табл. 9-3). Здесь показаны изображения (в масштабе) молекул трех ферментов, иллюстрирующие некоторые их структурные и функциональные особенности, выявленные при рентгеноструктурном анализе кристаллов этих ферментов. [c.250]

Главной целью при изучении механизма любой "реакции является выяснение структуры переходного состояния и природы промежуточных продуктов. В случае ферментативных реакций для определения структуры переходного состояния необходимо не только знакомство с геометрией молекулы субстрата, но также и знание трехмерной конформации фермента. Характерные для ферментативных реакций специфичность и высокая каталитическая эффективность определяются тем, что в данном каталитическом процессе участвует несколько функциональных групп фермента. В силу этого обстоятельства, а также из-за крайней сложности таких больших молекул, какими являются молекулы белка, точное определение структуры переходного состояния для ферментативных реакций представляется исключительно трудным. Приходится поэтому, по крайней мере в настоящее время, довольствоваться более простыми задачами 1) выяснением отдельных стадий реакции 2) идентификацией аминокислот, участвующих в связывании субстрата, а также в реакциях образования и разрыва связей 3) определением приблизительного располон епия этих аминокислот в пространетве и 4) разработкой такого гипотетического механизма реакции (с учетом специфической каталитической роли участвующих в реакции групп), который позволил бы объяснить наблюдаемую скорость ферментативной реакции (хотя бы порядок величины). К сожалению, полностью решить все эти задачи не удалось пока даже и в наиболее простых случаях. [c.195]