Эндонуклеаза сайты

Например, если экспрессируется класс А, то вырезаются все фрагменты ДНК, соответствующие классам М, D, G, Е, и образуется активный фрагмент ДНК, включающий в себя вариабельные гены, а также ген, кодирующий константную а-цепь. Если же клетка должна экспрессировать антитело, допустим, класса Е, то под влиянием Т-клеток и цитокинов происходит переключение классов. Перед каждым геном тяжелых цепей (кроме D-класса) имеется сайт переключения. При наличии сигнала от Т-клеток или цитокинов эти участки рекомбинируют друг с другом, а промежуточные гены (соответствующие цепям С , g и С ) вырезаются. Удаление промежуточных генов происходит следующим образом. При получении сигнала на переключение соответствующие участки рекомбинируют, при этом образуется петля цепи ДНК, которая вырезается эндонуклеазами. Сайты рекомбинации расположены в зонах интронов и в результате сплайсинга также удаляются. [c.488]

У эукариотических клеток, по-видимому, отсутствует аналог бактериальной системы рестрикции-модификации. Хотя у эукариот имеется метилированная ДНК и по крайней мере у некоторых — сайт-специфические эндонуклеазы (см. гл. IV). они не образуют единую защитную систему. Таким образом, защита эукариотических клеток от вирусов основана на совершенно других механиз.мах. [c.133]

Рис. 4.10. Частичный гидролиз фрагмента ДНК рестрицирующей эндонуклеазой типа П. Глубину гидролиза обычно контролируют изменением времени инкубации или количества фермента. Одни молекулы, представленные на рисунке, расщеплены по всем сайтам для рестрицирующей эндонуклеазы 1 (КЕ1-сайтам), другие только по некоторым.

Ранее был предложен имеющий много общего с описанными выше методами подход к получению делеционных субклонов в одноцепочечном векторе, основанный на построении с помощью Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I комплементарной цепи участков вставки, имеющих разную протяженность [Burton et al., 1988]. В цитируемой работе осуществлялся отжиг олигонуклеотидного праймера, в результате ферментативного удлинения которого происходило увеличение двуцепочечного участка вставки, причем производимый по времени отбор аликвот данной реакции обеспечивал получение их разной протяженности (рис. 8.14). Далее остающийся недостроенным одноцепочечный участок вставки и самого вектора удалялся нуклеазой S1. Затем с помощью подходящей рестрикционной эндонуклеазы, сайт которой находился в полилинкере поблизости от места клонирования вставки, вырезались делетированные варианты вставки. Их дальнейшее лигирование с заранее приготовленным вектором проводилось с таким расчетом, что происходила реориентация вставки, позволяющая секвенировать фрагменты ДНК со стороны делеций, давая, таким образом, возможность получить перекрывающиеся участки секвенируемой последовательности ДНК. [c.263]

Длинные клонированные вставки, входящие в состав X- или космидного вектора, часто бывают весьма неудобными для манипулирования. Поэтому после построения частичной рестрикционной карты вставку можно разделить на более мелкие фрагменты путем субЕлонирования. В принципе субклонирование не отличается от других методов создания рекомбинантных ДНК, просто в этих случаях в качестве исходного генома используют рекомбинантный клон. Для субклонирования обычно применяют рестриктирующие эндонуклеазы, сайты [c.318]

После действия ДHK-N-rликoзилaзы в ДНК остается АР-сайт. Репарация такого повреждения может идти одним из двух путей. У эукариот был обнаружен фермент ДНК-иксертаза, способный непосредственно пришивать к дезоксирибозе основание в соответствии с комплементарной цепью ДНК- Пока обнаружены лишь пуриновые инсертазы, видимо вследствие того, что апуринизация происходит значительно чаще, чем потеря пиримидинов- Второй путь репарации открывают ферменты, обнаруженные у всех организмов,— kV-эндонуклеазы. АР-эндонуклеазы разрывают саха- [c.76]

Механизмы С. у разл. классов РНК различаются между собой. Для всех них характерна точность удаления интронов и соединения экзонов. Специфичность удаления единств, интрона, если он имеется в пре-тРНК, обеспечивается ее трехмерной структурой. Эндонуклеаза, ассоциированная с ядерной мембраной, с участием др. ферментов расщепляет предшественник на участках (сайтах) по краям интрона с образованием на концах экзонов 2 , 3 -циклофосфатного и 5 -гидроксильного концов (рис. 1). Соединение этих кон- [c.409]

В генетической инженерии с целью получения белков в достаточных количествах и с заданными свойствами (например, для генотерапии наследственных и соматических болезней) широкое применение получили эндонуклеазы рестриктазы, катализирующие расщепление молекулы двухцепочечной ДНК по специфическим нуклеотидным последовательностям внутри цепи. Рестриктазы узнают определенные 4-7-членные последовательности, вызывая, таким образом, разрывы в определенных сайтах цепи ДНК. При этом образуются не случайные последовательности, а фрагменты ДНК строго определенной структуры с липкими концами (рекомбинантные ДНК), используемые далее для конструирования гибридных молекул и получения генно-инженерной, биотехнологической продукции (например, инсулина, гормона роста, интерферона, вакцин против вируса гепатита В, СПИДа и др.). [c.481]

При молекулярном клонировании важно, чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строго определенньгх участках (сайтах) с образованием дискретного и воспроизводимого набора фрагментов. Если пропустить хромосомную ДНК через шприц с иглой малого диаметра или обработать ее ультразвуком, то мы получим фрагменты длиной от 0,3 до 5 т.п.н. К сожалению, в ходе этих простых операций разрывы двухцепочечных молекул происходят случайным образом, так что при каждой обработке препарата ДНК получается совершенно новый набор фрагментов. Молекулярное клонирование стало возможным только после вьщеления высокоспецифичных бактериальных ферментов, которые узнают определенные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и расщепляют обе цепи. Эти ферменты называются рест-рицирующими эндонуклеазами типа II. [c.50]

Палиндромные последовательности, которые распознаются рестрицирующими эндонуклеазами типа Пив которых происходит расщепление молекулы ДНК, называются сайтами узнавания. Помимо рестриктаз, гидролизующих (расщепляющих) полинуклеотидную цепь с образованием линюгх концов, существуют рестрик-тазы, которые вносят разрывы в цепи строго друг против друга с образованием фрагментов ДНК с тупыми концами (рис. 4.3). Сайты узнавания могут состоять из четырех, пяти, шести, восьми или более пар нуклеотидов (табл. 4.1). От длины сайта узнавания зависит частота его распространения в молекуле ДНК в большинстве случаев используют рестриктазы, узнающие тет-ра- и гексануклеотиды. [c.53]

Для получения линкеров синтезируют олигомеры, которые представляют собой палиндромные одноцепочечные нуклеотидные последовательности, спаривающиеся (гибридизующиеся) между собой. Линкеры содержат сайты узнавания для рестрицирующих эндонуклеаз, что позволяет осуществлять с их помощью клонирование фрагментов ДНК (рис. 5.8, А и Б). Короткий дуплекс длиной 6-12 пар нуклеотидов лигируют по тупым концам с ДНК-мишенью (обычно кДНК). Разрезают новую молекулу нужной рестрицирующей эндонуклеазой и получают фрагменты с выступающими одноцепочечными концами (липкими концами), с помощью которых встраивают ДНК-мишень в соответствующий вектор. Прежде чем проводить встраивание, рестрицированную смесь фракционируют для отделения ДНК с липкими концами от лишних линкерных молекул. Вектор тоже обрабатывают рестриктазой, отжигают его с фрагментами ДНК с липкими концами и сшивают с помощью ДНК-лигазы фага Т4. ДНК-мишень не должна содержать сайтов рестрикции, присутствующих в линкерной последовательности, в противном случае она также будет расщепляться ферментом. [c.85]

Рис. 6.5. Клонирующий вектор pAVlO (без соблюдения масштаба). Показано положение гена устойчивости к тетрациклину (Tef), сайта рестрикции для эндонуклеазы Bglll, сайта инициации репликации (ori), промотора (р) и полилинкера (ПЛ). Встраивание клонированного гена в полилинкер ставит его под контроль промотора Тп5 (р). Стрелка указывает направление транскрипции.

Рис. 6.7. Клонирующий вектор системы слияния. Он содержит ген устойчивости к ампициллину (Атр ) в качестве селективного маркера, 5 -концевой сегмент гена ompF, кодирующий N-конец наружного мембранного белка, сайт для рестрицирующей эндонуклеазы АЬс и укороченный ген -галактозидазы (la Z). Ген, который хотят клонировать, встраивают в Ab l-сайт. После транскрипции и трансляции этой генетической конструкции образуется трехкомпонентный химерный белок.

Другой подход основан на использовании синтетических ориентированных адапторов — коротких олигодезоксинуклеотидов, присоединенных к концам линеаризованной плазмидной ДНК и к концам фрагментов ДНК с клонируемым геном. При лигировании эти фрагменты располагаются только в одной ориентации. Описанная процедура технически значительно более проста, чем та, в которой используется рестрицирующая эндонуклеаза Aval кроме того, она не требует, чтобы в гене-мишени отсутствовали Aval- и соШ-сайты. [c.118]

Частоту появления рекомбинантных бакуловирусов удалось повысить с менее чем 1% до 99%. Для этого ДНК A MNPV обрабатывали эндонуклеазой рестрикции, которая расщепляла ДНК в двух специфичных сайтах с высвобождением фрагмента, несущего часть гена, необходимого для осуществления литического цикла. Клетки насекомого трансфицировали этим фрагментом, а затем — транспортным вектором. В результате двойного кроссинговера в некоторых клетках восстанавливался кольцевой геном A MNPV, который содержал клонированный ген и функциональный ген, необходимый для осуществления литического цикла. В результате почти все вирулентные бакуловирусы оказывались рекомбинантными. [c.155]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология