Фракционирование нуклеозидов и нуклеотидов

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ [c.491]

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ ОСНОВАНИЙ, НУКЛЕОЗИДОВ И НУКЛЕОТИДОВ [c.316]

В литературе описаны попытки использования сефадексов и биогелей, представляющих собой соответственно сшитый декстран и гранулированный полиакриламидный гель, для разделения компонентов нуклеиновых кислот за счет различного сродства их молекул к сорбенту [32, 33]. Однако в основном гель-хроматографию применяют для фракционирования нуклеиновых кислот и их компонентов в соответствии с размерами молекул этих соединений. Например, на колонке с сефадексом 0-10 нуклеозиды и нуклеотиды отделяются от неорганических солей (выходят со свободным объемом колонки) [34]. Аналогичным образом олигонуклеотиды, содержащие больше 10—15 нуклеотидных остатков, не задерживаются на сефадексе 0-25 или 0-50, а мононуклеотиды проникают в поры геля и поэтому элюируются значительно медленнее [3]. Именно этот метод широко используют для удаления избытка нуклеозидтрифосфатов из смеси биосинтетических олиго- и полинуклеотидов [35]. [c.167]

Рандерат и Струк [70] рекомендуют для фракционирования нуклеозид-монофосфатов, нуклеозиддифосфатов и нуклеозидтрифосфатов на бумаге или слое целлюлозы смесь и-бутанол — ацетон — ледяная уксусная кислота — 5%-пый аммиак — вода (9 + 3 + 2 + 2 + 4) (табл. 114). Если зти же компоненты смешать в соотношении 7 + 5 + 3 + 3 + 2, то получится растворитель, даюш,ий хорошее разделение на слое целлюлозы (табл. 114) и пригодный также для фракционирования нуклеотидов на слое силикагеля Г [71]. Для достижения сравнимых результатов с этой системой в случае слоя целлюлозы достаточно 90 мин, в то время как в случае силикагеля Г необходимо 150 мин. Щелочные растворители, конечно, не могут быть непосредственно использованы на силикагеле Г для разделения сильнокислых нуклеотидов. Рандерат [69] указывает, что добавка 15 г этилендиаминте-трауксусной кислоты на 200 мл растворителя улучшает разделение. [c.443]

Для разделения сложных смесей, содержащих вещества разных классов (основания, нуклеозиды, нуклеотиды и их поли-фосфаты, олигонуклеотиды, включая олигонуклеотиды, различающиеся порядком основании, и т. п.), с которыми имеют дело, например, при выделении кислоторастворнмой части клеток или тканей или при анализе ферментативных гидролизатов нуклеиновых кислот, применяют исключительно ионообменную хроматографию. В случае необходимости дальнейшее фракционирование проводят по многостадийной схеме, с использованием указанных выше методик. При этом наблюдаются те же закономерности, что и при анализе нуклеотидов (см. предыдущий раздел), поэтому в дальнейшем будет приведено лишь несколько примеров. [c.58]

Очевидно, что многие нуклеозиды являются интермедиатами в биосинтезе н расщеплении нуклеотидов и полинуклеотидов. В дополнение к так называемым спонгонуклеозидам (термин, применяемый к модифицированным пуриновым нуклеозидам, полученным из карибской губки ryptotethya rypta), которые являются производными арабинозы, многие антибиотики являются производными нуклеозидов, часто имеющих модифицированные углеводные остатки они будут детально обсуждаться позднее. Нуклеозиды сравнительно легко выделить из химических или ферментативных гидролизатов природных полинуклеотидов условия и практические детали этого процесса можно найти в общих учебниках по нуклеиновым кислотам [2, 7, 24]. Все коммерчески доступные образцы основных нуклеозидов получены этим путем. Для выделения больщих количеств таких нуклеозидов наиболее целесообразно применение относительно грубого фракционирования, основанного на различной растворимости, и методов ионного обмена. Для выделения малых количеств модифицированных нуклеозидов либо из природного источника, либо полученных в результате химического синтеза, пригодны многочисленные более эффективные методы, и они будут обсуждаться отдельно. Наконец, следует помнить, что выделение нуклеозидов часто осуществляют дефосфорилированием нуклеотидов [25], выделение и разделение которых не будет рассматриваться в настоящей главе. [c.72]

Эта техника имеет преимущества перед распределительной и адсорбционной хроматографией, когда она используется для фракционирования больших количеств материала, растворенного в воде. Очевидно, что основное использование ионообменной хроматографии состоит в выделении и фракционировании полинуклеотидов и нуклеотидов, но величины рКа гетероциклических оснований таковы, что в интервале pH 4—10 некоторые нуклеозиды могут нести по меньшей мере частичный заряд и, следовательно, могут быть разделены этим методом. Для ионообменника используют два основных типа подложки либо полистирол, либо целлюлозу, и оба типа широко использовались для разделения нуклеозидов. В ероятно, наиболее широко используется метод. [c.73]

Подробный анализ процесса хроматографии нуклеиновых кислот и их продуктов гидролиза на ионообменнике был опубликован Коном [14, 22, 23], а также Собером и Петерсоном [81]. Рандерат впервые описал фракционирование низкомолекулярных осколков нуклеиновых кислот (нуклеиновых оснований, нуклеозидов и мононуклеотидов) на эктеола [68, 69, 73] и на слоях ДЭАЭ [72, 73]. Он установил, что нуклеотиды можно разделить методом ионообменной ХТС значительно быстрее и лучше, чем при использовании других методов кроме того, метод ХТС значительно чувствительнее метода хроматографии на бумаге. [c.447]

При разделении защищенных нуклеозидов, например ано-мерных рибофуранозилпроизводных урацила, в качестве сорбента с успехом используют нейтральную окись алюминия, а в качестве элюента — смеси бензола и этилацетата в разных пропорциях [44, 45, 84, 85]. В табл. 37.6 приведены значения Ка основных нуклеозидов на колонке с сефадексом на основании этих данных можно оценить возможность разделения той или иной смеси методом гель-проникающей хроматографии при использовании элюентов различного состава [47, 48, 67—69]. Хорошие результаты дает разделение на обычных или специально фракционированных биогеле Р-2 [86, 87] и сефадексе 0-10 [88]. Показано, что эти два геля можно использовать для определения нуклеотидного состава нуклеиновых кислот (рис. 37.11). Биогель Р-2 применяют также для разделения нуклеозидов в присутствии большего количества нуклеотидов, которые в этом случае элюируются существенно быстрее, чем на сефадексе 0-10. Хроматографию на биогеле Р-2 или сефадексе 0-10 неоднократно использовали в качестве микроаналитического метода при определении нуклеозидного состава энзиматических гидролизатов ДНК [89—91] и идентификации концевых нуклеотидов [92]. Смесь рибо- и дезоксирибонуклеозидов разделяли на колонке с фракционированным биогелем Р-2 в буферном растворе (pH 10,1), содержащем тетраборат натрия (рис. 37.12) [87]. Для отделения тимидина от 5-бром- и 5-иоддезоксиуридинов предложено проводить хроматографию на сефадексе 0-10 в фос-фатноцитратном буферном растворе с pH 3,5 [93, 94]. [c.53]

Описано несколько других систем, которые катализируют включение концевых рибонуклеотидов в РНК- Они, возможно, и не имеют отношения к специфическому синтезу РНК de novo, так как рибонуклеиновые кислоты, вероятно, образуются путем постепенного присоединения нуклеотидов и концевые фрагменты, по-видимому, должны быть более чувствительны к обратимому пирофосфоро-лизу, чем внутренние нуклеотиды. Однако важным фактором при включении в концевые группы может быть отсутствие подходящего рибонуклеозид-5 -трифосфата. В различных рибонуклеиновых кислотах было идентифицировано около тринадцати различных нуклеозидов при попытке вызвать ферментативную полимеризацию-четырех основных нуклеотидов встретились затруднения, препятствующие образованию полинуклеотида с достаточно высокой длиной цепи. Тем не менее существуют прямые доказательства синтеза полирибонуклеотидов из рибонуклеозид-5 -трифосфатов в животных системах. Например, экстракты из ядер зобной железы теленка после фракционирования дают ферментные препараты, которые катализируют образование полиадениловой кислоты (длиной 25—100 нуклеотидов) из аденозин-5 -трифосфатов. В присутствии затравочной РНК цитидин-5 -трифосфат превращается в по-лицитидиловую кислоту частично очищенным ферментом (в отличие от фермента, специфичного для АТФ) из того же самого источника. В случае других систем животных (ядра печени крысы) моно-нуклеотидный остаток цитидин-5 -трифосфата (а-Р ) включается во внутренние участки, а не в конец цепи. Включение заметно стимулируется АТФ, ГТФ и УТФ, в то время как рибонуклеаза и дезоксирибонуклеаза заметно понижают включение. [c.318]

Методы, собранные в этих двух книгах, весьма разнообразны и охватывают почти все стороны исследований этой важнейшей грунны соединений. Здесь можно найти методы выделения и анализа отдельных компонентов нуклеиновых кислот (пуриновых и пиримидиновых оснований, нуклеозидов и нуклеотидов), методы выделения, разделения и анализа олигонуклеотидов, изолирования отдельных клеточных органелл, выделения и фракционирования нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), а также изолирования их суммарной фракции для различного рода исследований, способы идентификации нуклеиновых кислот, методу. модификации их молекул, методы изучения их синтеза как in vivo, так и in vitro, методы изучения нуклеиновых кислот в связи с процессом биосинтеза белка и, наконец, методы изучения биологических свойств нуклеи1говых кислот, в том числе их иммунологических свойств. [c.5]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология