Анализ ферментативный

Кинетическое описание ферментативных реакций в нестационарном режиме связано с определенными математическими трудностями. Например, для анализа реакции, протекающей по схеме Михаэлиса — Ментен (схема 5.1), необходимо решить систему дифференциальных и алгебраических уравнений (5.2)—(5.5). Формально-кинетический анализ ферментативных реакций развивается как по пути использования численных методов интегрирования систем дифференциальных уравнений, так и по пути использования аналитических методов. Аналитическое решение имеет определенные преимущества. Поэтому важно указать, что аналитическое решение системы дифференциальных и алгебраических уравнений может быть существенно упрощено, если при использовании определенных условий систему можно трансформировать в линейную систему уравнений. Развитие методов нестационарной кинетики ферментативных реакций идет именно по этому пути. [c.175]

Кинетический анализ ферментативных реакций, не подчиняющихся уравнению Михаэлиса — Ментен [c.235]

ПРИМЕНЕНИЕ интегральной ФОРМЫ УРАВНЕНИЯ СКОРОСТИ ДЛЯ кинетического анализа ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИИ [c.166]

В гл. I мы указывали, что реакции, катализируемые ферментами, до стигают относительно высоких скоростей, поскольку превосходят каталитические неферментативные реакции по скорости более чем в Ю - раз. Кинетический анализ ферментативных механизмов позволяет прий- [c.273]

Анализ ферментативных гидролизатов белков. В 1957 г. Ингрэм [61 впервые показал, что двухэтапным разделением с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге можно анализировать сложные пептидные смеси, ферментативные гидролизаты и т. п. Такой анализ выявляет самые незначительные различия, с которыми можно встретиться, например, при изучении видовой специфичности или в других сравнительных исследованиях. Метод отпечатков пальцев можно назвать одним из важнейших методов современной биохимии, молекулярной биологии и иммунохимии, так как он позволяет выделить в чистом виде определенный пептид или провести микропрепаративное разделение сложной смеси. [c.103]

В последнее время метод отпечатков пальцев все чаще осуществляют в три этапа, комбинируя два электрофоретических разделения с хроматографией. Дело в том, что двухэтапный метод отпечатков пальцев не всегда дает полное разделение, особенно при анализе ферментативных гидролизатов высокомолекулярных белков, поэтому возникает необходимость дополнительного электрофоретического фракционирования (фиг. 21). [c.104]

Различные обозначения, используемые при кинетическом анализе ферментативных реакций с участием двух субстратов [c.178]

Как будет видно из дальнейшего, применение этих соотношений к анализу ферментативных реакций нельзя считать вполне строгим. Прежде всего, нельзя признать правильным предположение о том, что при добавлении [c.200]

Помимо указанных применений, развитая теория дает возможность уточнить и обобщить методы математического анализа ферментативных процессов, которыми располагает современная биохимия и которые дают результаты, согласую- [c.22]

Согласно этой теории (на ее основе проводится всесторонний анализ ферментативной кинетики и ингибирования) фермент Е сначала реагирует с субстратом 8, в результате чего образуется фермент-субстратный комплекс Е8, распадающийся за- [c.114]

Анализ ферментативных механизмов с помощью моделей ингибирования продуктом [c.354]

Оригинальный подход к теории скоростей реакций разработал в 1935 и последующих годах Эйринг. Теорию Эйринга называют теорией переходного состояния, так как в ней в качестве основного процесса рассматривается распад активированного комплекса на вершине энергетического барьера. Эту теорию можно применить к одной или к нескольким молекулам и описать с ее помощью процесс активации реагирующих молекул как искажение, за счет которого происходит их превращение в продукты. С точки зрения данной теории активированное состояние представляет собой как бы полустанок, на котором в основном присутствуют ослабленные комплексы с необычной ориентацией связей, но существование их преходяще. Эта концепция особенно полезна при анализе ферментативных реакций. [c.366]

В уравнениях химической и биологической кинетики роль малых параметров часто играют постоянные времени быстрых процессов различных порядков. В других случаях в качестве малого параметра выступает отношение малых концентраций к большим. Это также соответствует различным скоростям изменения переменных, поскольку скорость изменения большой концентрации, как правило, меньше, чем скорость изменения малой концентрации. Такая ситуация часто возникает при анализе ферментативных процессов (см. гл. III). [c.52]

L Обнаружение и анализ ферментативных нарушений [c.12]

Некоторые общие выводы по анализу ферментативных нарушений у человека [c.69]

Обнаружение дефектов ферментов. Анализ ферментативных нарушений у человека позволяет сделать несколько выводов. Чтобы дефект фермента можно было обнаружить, он должен проявляться в клетках крови или в культуре фибробластов. Более того, этот дефект должен приводить к четким клиническим симптомам или к изменениям, выявляемым при обычном обследовании (например, выделение необычных метаболитов с мочой). Врожденное нарушение с неспецифическими симптомами, которое не сопровождается легко регистрируемыми биохимическими отклонениями, не может быть обнаружено. [c.69]

Значение ферментативных дефектов для прояснения метаболических путей. Не сложно обнаружить ферментативное нарушение, если уже известен тот метаболический путь, в котором этот фермент принимает участие. В некоторых случаях, наоборот, анализ ферментативных дефектов проливает свет на неизвестный еще метаболический путь, который трудно исследовать другим способом. Ярким примером могут служить мукополисахаридозы. [c.69]

Исследование обмена по циклу Кребса у грибов проводится теми же путями, что и при изучении процесса гликолиза. Оценка по анализу ферментативных систем цикла ТКК затрудняется тем, что большинство его ферментов, в противоположность ферментам путей гликолиза, находящимся в цитоплазме, локализуется в органоидах клетки — митохондриях, легко разрушающихся при их изоляции в бесклеточных экстрактах грибов. При работе с этими ферментами потребовалась разработка специальных мягких методов выделения митохондриальных фракций клеток и последующего отделения ферментов от структурных белков митохондрий, с которыми они связаны, без потери их активности. Для этого было применено быстрое механическое разрушение клеток в подходящем растворителе, заключение их в раствор сахарозы, препятствующий набуханию митохондрий, удаление вредных металлов и т. д. Дыхательные гранулы из митохондрий, активно дышащие и крася- [c.70]

Метод изотопного обмена позволяет упростить анализ ферментативной реакции, подчиняющейся механизму с замещением фермента, поскольку в этом случае можно изучать только половину реакции [c.137]

Пример количественного анализа ферментативной активности определение содержания дегидрогеназы [c.68]

Первый этап состоял в определении спектров-эталонов трех радикалов, наиболее существенных для анализа ферментативных реакций гидроксила, свободной карбонильной группы и свободной амино- или имино-группы. Определение было основано на том, что при фотодиссоциации данного тела возникают следующие возможности [c.13]

В целях упрощения обработки кинетики квазиравновесных ферментативных реакций с помощью метода графов, М. В. Воль-кенштейн с сотрудниками разработали так называемый диаграммный метод анализа ферментативной кинетики [5—8]. Согласно данному методу, дальнейшее упрощение анализа графов достигается тем, что для обратимых стадий ферментативного процесса выписываются не константы скорости, а константы равновесия. В этом случае линии, соединяющие вершины графа, называют дугами (аналоги ветвей в графах стационарных реакций). Величина дуги равна отношению констант скоростей прямой и обратной реакции (по отношению к ориентации дуги). Дуги ориентируются от входа, за который обычно принимают состояние свободного фермента. Наконец, выходом диаграммы называют вершину, из которой получается продукт ферментативной реакции и свободный фермент. В этом случае из выхода ведет не дуга, а ветвь, величина которой равна константе скорости стадии образования продукта. [c.292]

Для разделения сложных смесей, содержащих вещества разных классов (основания, нуклеозиды, нуклеотиды и их поли-фосфаты, олигонуклеотиды, включая олигонуклеотиды, различающиеся порядком основании, и т. п.), с которыми имеют дело, например, при выделении кислоторастворнмой части клеток или тканей или при анализе ферментативных гидролизатов нуклеиновых кислот, применяют исключительно ионообменную хроматографию. В случае необходимости дальнейшее фракционирование проводят по многостадийной схеме, с использованием указанных выше методик. При этом наблюдаются те же закономерности, что и при анализе нуклеотидов (см. предыдущий раздел), поэтому в дальнейшем будет приведено лишь несколько примеров. [c.58]

В 1888—1892 гг. Г. Тамман в Дерпте выполнил серию работ, 1) которых использовал кинетические нредставления для анализа ферментативных процессов. Он пришел к следующему общему выводу, что пеоргапизовапные ферменты ускоряют гидролитические реакции так же, как и кислоты, по действие первых отличает- [c.356]

Ряд авторов с успехом использовали хроматографию в тонком слое для анализа ферментативных гидролизатов белков 13, 7, 16, 17]. Двумерной хроматографией можно получить пептидные карты в системах хлороформ — метанол — 25%-ный ЫН40Н (2 2 1) и пиридин — уксусная кислота — бутанол — вода (40 14 68 25) (двукратная хроматография). [c.237]

Наиболее широкое распространение для анализа ферментативных гидролизатов лигноцеллюлозных материалов нашел метод разделения глюкозы и целлоолигосахаридов на силикагеле, модифицированном аминогруппами. Это связано с изократичес-ким режимом элюции сахаров смесью ацетонитрил-вода, доступностью и относительно низкой стоимостью колонок, отсутствием необходимости предколоночной модификации образцов, простотой рефрактометрической регистрации продуктов. Метод позволяет определять концентрацию целлоолигосахаридов на уровне 0,5-10 г/л, а применение в качестве детектора интерференционного или лазерного рефрактометрических детекторов позволяет регистрировать сахара с чувствительностью, сопоставимой с ферментативными и химическими методами — на уровне 0,1 г/л и менее. [c.134]

Научные работы посвящены изучению механизмов действия ферментов и других физиологически активных веществ, а также инсектицидов. Установил (1950-е) механизм взаимодействия фосфорорганических инсектицидов с ферментом холннэстеразой, что позволило планировать (с 1967) синтез новых инсектицидов и лекарственных веществ с антихолинэстеразным действием. Развил исследования по кинетическому анализу ферментативных реакций в присутствии необратимо действующих ингибиторов. Изучил электронный механизм ферментативной фиксации азота, выделил участвующие в этом процессе белки, содержащие железо негеминовой природы и молибден (1963—1966). Изучал (с 1967) кинетику и механизм действия ко-ферментов. [23] [c.603]

В работе А. П. Бресткина и сотрудников [4] проверена применимость изложенного метода к кинетическому анализу ферментативного гидролиза монофенил фосфата, катализируемого щелочной фосфатазой (фосфогидролаза моноэфиров ортофосфата, КФ 3.1.3.1). В соответствии с уравнением (УП1.12), скорость гидролиза линейно зависела от концентрации фермента (использован кристаллический препарат фосфатазы). Фермент ингибировался избытком субстрата, причем [5]опт. в соответствии с уравнением (УП1.13), не зависела от концентрации фермента и была равна 4,3-10 М. Уста- [c.97]

Чтобы определить, связано ли повышение активности ферментов при регенерации с их новообразованием, мы воспользовались актиномицином Д, который блокирует ДНК-зависимый синтез РНК и тем самым выключает появление новых белков. Установлено, что введение животным актиномицина Д в количестве 70 мкг/ 00 г веса тела через 1 час после гепатэктомии снимало возрастание активности ферментов. Если антибиотик вводили за 1 час до анализа, то он не оказывал никакого влияния. Следовательно, актиномицин Д не действует па ферментативные реакции. На основании полученных данных можно сделать вывод, что увеличение активности дезаминазы дЦМФ и фосфорилирующих тимидин ферментов при регенерации печени обусловлено их новообразованием, для которого необходим ДНК-зависимый синтез РНК. Опыты с облучением животных дозой 1000 р показали, что гамма-радиация не влияла непосредственно на активность дезаминазы дЦМФ (облучение за 1 час до анализа ферментативной активности), но угнетала новообразование как дезаминазы, так и фосфорилирующих тимидин ферментов (облучение перед операцией или через 1 час после нее). [c.142]

Далее было показано, что ДНК-матрица, добавленная к реакционной смеси, не только необходима для полимеризации, но фактически определяет характер образуемого полинуклеотида. Это послужило наиболее убедительным доводом в пользу того, что реакция, катализируемая ДНК-по-лимеразой in vitro, представляет собой не случайную полимеризацию нуклеотидов, а действительно приводит к репликации ДНК. Так, из результатов, приведенных в табл. 12, видно, что продукты ферментативных реакций, образованные в присутствии различных матричных ДНК, различающихся по содержанию [Г] + [Ц в пределах от 44 до 68%, очень напоминают по составу оснований их матрицы. Более того, последующий более тщательный анализ ферментативно синтезированного полинуклеотида показал, что матричная ДНК контролирует не только общий нуклеотидный состав продукта—образующегося полинуклеотида, но и относительную частоту соседствования любых двух оснований в реплицирующейся полинуклеотидной цепи. [c.210]

Пример 11-3. Измерение изменений величины мутантного фермента. Многие методы, применяемые для определения молекулярных масс ферментов, требуют образцов с высокой степенью очистки (например, метод седиментационного равновесия, который будет описан позже) или при использовании не очень чистых образцов дают массы субъединиц (например, ДСН-гель-электрофорез, гл. 9). Использование зональной седиментации позволяет определить молекулярную массу активного фермента непосредственно в неочищенном лизате при применении в качестве метода контроля анализа ферментативной активности. Например, ДНК-полимераза I Е. oli седиментирует при 5 = 5,4. Зоны полимери-зующей и 5 —З -экзонуклеазной активности, связанные с этим белком, седиментируют вместе, поэтому для локализации фермента в градиенте сахарозы можно использовать любую из них. Мутантная форма фермента не обладает полимеразной активностью, однако сохраняет 5 —З -экзонуклеазную. Как следует из рис. 11-26, мутантный фермент обладает значением s = 2,8. Поскольку данная мутация является терминирующей цепь белка, пониженное значение 5 указывает на то, что данный фермент является лишь небольшим фрагментом белка дикого типа и имеет только 0,4% активности. [c.314]

Исходя из общебиологической концепции о виде как гетерогенной популяции /49, 50/, осуществлен анализ ферментативных свойств многочисленных внутривидовых изолятюв наиболее распространенных видов термофильных грибов. Показаны значимость и степень специфичности отдельных вщов к ферментативному гидролизу белков, целлюлозы. крахмала, ксилана, пектинов и некоторых другюс субстратов. Полученные данные имеют значение для выяснения возникновения трофических связей термофильных грибов в определенных экологических нишах, а также могут быть использованы при селекции природных мутантов разных видов термофильных грибов, обладатих высокой ферментативной актив ностью. [c.4]

Наши предположения о наличии видовой специфичности свойств ферментов, особенно гидролаз, у наиболее распространенных видов термофильных грибов основывались как на общебиологических современных концепциях о виде как гетерогенной системе особей с различными свойствами, так и на селективном воздействии субстратов в сравнительно ограниченных экологических нишах термофильных грибов. Проведенный анализ ферментативных свойств большого числа внутривидовых изолятов (более 1000) видов облигатных термофильных грибов позволил в количественном выражении (по коэффициенту распределения внутривидовых изодятов) установить вддоспецифичность ферментативных свойств разных вццов термофильных грибов в отношении падролиза различных полимерных субстратов (белков, целлюлозы, крахмала, ксилана, гдю-кана, пектина и др.). Полученные результаты характеризуют по ферментативным свойствам внутривидовых изолятов отдельные виды термофильных грибов. Исследования, проведенные в этом направлении, и полученные результаты позволяют подойти к трактовке характера трофических связей отдельных видов термофильных грибов в экологических нишах и их обусловленности ферментативными свойствами. Эти данные могут быть использованы в прогнозировании поисков промышленных продуцентов ферментов среди разных видов термофильных грибов. [c.146]

Цеииость теории переходного состояния заключается в том, что она связывает скорость реакции с разностью энергий Гиббса для переходного и основного состояний. Это особенно важно при рассмотрении относительной реакционной способности субстратов или при сравнении скорости данной реакции в различных условиях. Иногда удается рассчитать отношение скоростей или в более обшем случае качественно определить характер изменения реакционной способности. Например, шелочной гидролиз такого эфира, как фенилацетат, включает атаку нейтрального реагента в основном состоянии отрицательно заряженным гидроксил-ионом. Это означает, что переходный комплекс должен нести некоторый отрицательный заряд, перенесенный на эфир. Можно ожидать, что л-нитрофенилацетат является более реакционно-способным соединением, чем фенилацетат, поскольку нитрогруппа оттягивает на себя электрон и стабилизирует отрицательно заряженное переходное состояние. Рассмотрим спонтанное разложение трет-бутилбромида на ион трет-б илкарбония и бромид-ион. Переходное состояние этой реакции должно иметь биполярный характер, поэтому полярный растворитель (например, вода) будет стабилизировать его, а неполярный (например, диэтиловый эфир)—дестабилизировать. В гл. 10 и 11 мы рассмотрим применение теории переходного состояния для количественного анализа ферментативных реакций—выявления зависимости реакционной способности и специфичности от структуры при дискретном изменении структуры субстрата. [c.49]