Нингидриновая колориметрия

I, 2 — насосы для подачи буферных растворов 3 — насос для подачи нингидринового реагента 4, 5 — длинные колонки в, 7 — короткие колонки 8 — автоматический кран для переключения буферов 9 — реактор (тефлоновый капилляр, длиной 30 м с внутренним диаметром 0,7 мм, в кипящей водяной бане) /А — колориметр с тремя кюветами (570, 440 и 570 нм с пониженной чувствительностью) /7 — трехканальный самописец /2 —ротаметр 13 — ультратермостат. [c.318]

Наиболее общим методом определения концентрации пептидов является колориметрия продуктов реакции с нингидрином [2]. Это один из наиболее чувствительных колориметрических методов. Для обнаружения аминокислот и пептидов разработаны как обычный, так и полностью автоматизированный варианты, причем нингидриновый реагент не вызывает коррозии и его можно подавать обычным микронасосом. Реакция идет по свободным аминогруппам, но в некоторых случаях хромофор образуется с низким выходом. Данные по окрашиванию дипептидов можно найти в работе [3]. У всех дипептидов, содержащих в качестве Ы-концевой аминокислоты аргинин, треонин, серин, глутаминовую кислоту, глицин, фенилаланин, метионин, лейцин и тирозин, интенсивность окраски составляет 1,6-10 у лейцина эта величина составляет 1,7-10 . У дипептидов с М-концевым лизином и аспарагиновой кислотой интенсивность окраски несколько выше (на 20 и 29% соответственно), а дипептиды с Ы-концевым гистидином и триптофаном проявляются несколько слабее (42 и 67% соответственно от средней интенсивности). Дипептиды с М-концевым пролином, валином и изолейцином окрашиваются очень слабо [2,7 6,4 и 8,5% от средней (1,6- 10 ) интенсивности]. [c.391]

По сравнению с нингидриновой колориметрией здесь чувствительность несколько ниже ( 50—60%), однако несомненным преимуществом является возможность регенерации пептидов. [c.393]

Джонс [88] подробно описал установку для хроматографического анализа пептидов, пригодную как для препаративного (/ 100 мг), так и для аналитического (0,1—1 мг смеси пептидов) разделения. При работе на этой установке щелочной гидролиз не проводится. Эту методику называют прямым методом нингидриновой колориметрии , поскольку в ней используется модифицированный [67, 150] аминокислотный анализатор Спакмана с сотр. [186], который можно непосредственно применять для автоматической хроматографии пептидов [89]. В установке можно использовать блоки различных автоматических анализаторов заводского изготовления. Разделение ведется методом градиентного элюирования. Элюат делится на две части, большая часть направляется в сборник фракций, а [c.313]

Фракционирование пептидов на ионообменных смолах основано на целом ряде принципов, о которых уже говорилось выше (гл. I и II). Сюда входят и различия в электрохимических свойствах разделяемых фрагментов, и различное сродство неполярных радикалов к бензольным кольцам матрицы смолы, и изменение концентрации конкурирующих ионов в буферном растворе. Поэтому элюция пептидов со смолы достигается путем пропускания через колонку буферных растворов изменяющейся ионной силы и pH. Это изменение концентрации ионов и pH может осуществляться линейно или ступенчато. Элюируемые компоненты идентифицируют нингидриновой колориметрией, лиофилизуют (высушивают из замороженного состояния) и проверяют на гомогенность с помощью хроматографии на бумаге и методом пептидных карт. Негомогенные пики фракционируют дополнительно. В качестве примера можно привести разделение пептидов, полученных триптическим гидролизом окисленной (т. е. лишенной дисульфидных мостиков) рибонуклеазы (рис. 11). [c.84]

Количественное определение глютаминовой кислоты проводилось по следующему методу [12]. Хроматограмму протягивали через 1%-иый раствор нингидрина, испаряли ацетон на воздухе (1—2 мин) и для развития окраски пятен выдерживали в течение 25 мин в термостате при 60 . Нингидриковые производные аминокислот элюировали 4 мл 40%-ного метилового спирта i 2 мл 0,5%-ного раствора хлористого кадмия в 40%-ноы метиловом спирте в течение 2 ч. Растворы колориметрировали на колориметре ФЭК-М со светофильтром № 2 (длина волны 530 ммк). В связи с тем, что цветовой выход нингидриновых производных аминокислот подвержен некоторым колебаниям и оптические плотности растворов различаются даже для различных хроматограмм из одной камеры, на каждый лист наносили стандартный раствор аминокислоты в количестве 10—20у. [c.214]

В обычном аминокислотном анализаторе N -2 сохранен блочный принцип. Прибор снабжают одной или несколькими колонками (0,5X75 см). Анализ белковых гидролизатов может занять 2 ч 30 мин анализ образцов более сложного состава может длиться более 36 ч. Прибор имеет два колориметра, с полосами пропускания при 570 и 440 нм в случае необходимости можно использовать один колориметр с полосой при 410 нм. Полагают, что потерю чувствительности можно многократно перекрыть благодаря непрерывному 10-кратному расширению шкалы, что вообше является конструктивной особенностью этих колориметров. Для достижения максимального разрешения используют также рассечение потока пузырьками азота (что является характерной особенностью анализатора Te ni-соп), хотя новый состав нингидринового реагента, с использованием гидразинсульфата, делает излишним хранение его под азотом. Предел детектирования аминокислот составляет 1 нмоль. [c.325]

Интенсивность окраски реакционной смеси, получающейся при добавлении нингидринового реагента к эффлюенту, измеряется проточным колориметром в условиях постоянной скорости потока жидкости. Возникающее изменение напряжения на фотоэлементе регистрируется самописцем. Обычно выходное напряжение колориметра на самописец составляет О—5 мВ. При максимальном развитии окраски (наивысшая оптическая плотность, ОП) напряжение равно нулю, а при отсутствии, за исключением фона реагентов (фоновая линия), напряжение составляет 5 мВ. Для точной записи результатов хроматографического анализа самописец должен а) точно реагировать только на сигнал фотоэлемента калориметра б) допускать длительную работу с минимальным дрейфом из-за тепловых и электрических помех в) иметь постоянную скорость лентопротяжного механизма для обеспечения точной идентификации пиков по времени. Если запись на самописце производится на диаграммной бумаге с линейной шкалой, то для расчета пиков аминокислот или пептидов необходим шаблон с нанесенной сеткой ОП. Если самописец снабжен диаграммной бумагой со шкалой в единицах ОП или логарифмической шкалой, величина поглощения находится непосредственно. Другими вспомогательными элементами, которые связаны с записью анализа и считаются составными частями системы регистрации, являются устройства, осуществляющие расширение шкалы, логарифмирование сигнала, интегрирование пика, а также цифропечать и связь с ЭВМ. Расширение шкалы представляет собой метод, по которому вся шкала самописца может быть легко заменена с О—5,0 мВ на 4,0—5,0 или 4,5— [c.32]

При приготовлении описанного выше нингидринового реагента нам не раз приходилось встречаться с трудностями. Эти трудности обычно приписывались качеству метилцедлозольва. Важно, чтобы метилцеллозольв не только не содержал следов перекисей (<3 млн. д.), которые мешают протеканию цветной реакции с нингидрином, но и не вызывал помутнения раствора, как это бывает с некоторыми партиями, после контакта с воздухом (особенно если последний попадает при перемешивании нингидринового реагента). При использовании такого недоброкачественного метилцеллюлоза в ходе анализов образуется белый осадок, который удерживается на внутренних стенках трубки реактора и в кюветах колориметра. Этот осадок не похож на гидриндантин, так как он нерастворим в метилцеллозольве, но растворяется в разбавленной кислоте. Для уменьшения образования этого осадка после нингидринного насоса помещают специальный фильтр. [c.55]

Для количественного анализа удобно применять фотоэлектрические колориметры. Этот способ анализа бумажных хроматограмм описан, например, в работе Фишера и др. (1948). Хроматограмму после обработки нингидриновым раствором и высушивания вставляют в фотоэлектроколориметр, с помощью которого снимают кривую распределения интенсивности окраски по длине занимаемой аминокислотой зоны. Площадь под этой кривой пропорциональна количеству аминокислоты. Для вычисления же количества аминокислоты предварительно получают аналогичные кривые распределения для аминокислот с известным количественным содержанием. Точность этого способа варьирует в пределах 5—15% в зависимости от исследуемой аминокислоты. [c.152]

С 1951 г. введен ряд модификаций нингидринового реагента некоторые из этих модификаций удовлетворяют требованиям отдельных методик разделения аминокислот, другие — улучшают колориметрию. Метод Смита [96] отличается главным образом тем, что нингидрин, хлористое олово и буферные растворы прибавляют отдельно, а не в виде одного реагента. Мур и Стейн [4] изменили состав своего прежнего реагента, увеличив буферную емкость в пять раз прибавлением раствора ацетата натрия (pH 5,5). Это устранило необходимость отдельной нейтрализации фракций. Вместо хлористого олова в нингидриновый реагент был введен гидриндантин во избе- [c.145]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология