Комплексы карбоангидразы с сульфамидами

Изменение спектральных свойств под воздействием сульфамидов будет обсуждено в разд. 4. С помощью Н-ацетазоламида можно непосредственно показать, что для связывания этого сульфамида необходим ион металла (рис. 16.9, а) [21]. При концентрациях, меньших Ю М, ацетазоламид не связывается апоферментом, тогда каж Zn(II)-карбоангидраза присоединяет 1 моль ингибитора уже при концентрации последнего 5-10 М (рис. 16.9, а). Характерно, что подобный тип взаимодействия обнаружен только с цинковыми и кобальтовыми комплексами карбоангидразы—единственными активными разновидностями металлофермента (табл. 16.8). По-видимО му, только реакционноспособная конфигурация активного центра допускает возможность связывания сульфамидов [21]. [c.586]

КОМПЛЕКСЫ КАРБОАНГИДРАЗЫ С СУЛЬФАМИДАМИ [c.593]

Константы диссоциации для комплексов карбоангидразы с сульфамидами [c.595]

Этот механизм объясняет отсутствие ингибирования слабо связывающимися анионами при высоких значениях pH [101], возвращение спектральной картины комплексов Со (II)-карбоангидразы с анионами или сульфамидами к типичным спектрам щелочной формы неингибированного фермента, наблюдаемое также при высоких значениях pH [101], и смещение рН-зависимости в щелочную область в присутствии анионов [101]. Все эти явления вызваны конкуренцией с 0Н , который при достаточно больших концентрациях вытесняет анионы и реактивирует фермент. Этот механизм согласуется и с кинетическими данными, свидетельствующими о том, что в месте связывания анионов находится группа, основная форма которой существенна для гидратации СОг, а кислая форма необходима для дегидратации бикарбоната [99, 110]. Инфракрасные спектры комплекса карбоангидразы с [c.614]

У разных типов карбоангидразы величина и знак полос эллиптичности для комплексов с этим сульфамидом сильно различаются [30]. Очевидно, это является следствием различной молекулярной структуры областей, окружающих активный центр. К такому же заключению приводят и результаты, полученные методом Я МР с С1 [ 122, 123] и комплексометрическим титрованием [86]. Подобные структурные расхождения могут служить причиной неодинаковой удельной активности у изоферментов и видовых вариантов карбоангидразы [77]. [c.599]

Манн и Кейлин [19] обнаружили сильное ингибирование фермента из эритроцитов сульфамидами. Это свойство — особенность карбоангидразы, так как больще ни один из известных ферментов не ингибируется этими соединениями так же специфично. Поскольку эти ингибиторы сыграли очень важную роль в физико-химических и энзимологическихисследованияхфермента, разд. 4 посвящен детальному обсуждению свойств сульфамидных комплексов карбоангидразы. Хотя по своей природе сульфамиды не являются агентами, связывающими металлы в комплекс, последние данные свидетельствуют о том, что в молекуле фермента центр связывания сульфамидов содержит ион цинка в качестве одной из координирующих групп. Металл взаимодействует с группой —ЗОгМНг [20-23]. [c.561]

Величины констант диссоциации, рассчитанные по кинетическим данным для некоторых комплексов карбоангидразы с сульфамидами, изменяются от 2-10 для этонсзоламида до 2,6-10 для сульфаниламида и представлены в табл. 16.11. Исключительно низкие значения констант говорят о весьма высокой прочности связей в этих нековалентных комплексах. Эта особенность была использована для разработки удобного метода определения концентрации карбоангидразы титрованием ее растворов этокс-золамидом [103, 105, 112]. Как отмечалось выше, спектральные изменения при связывании сульфамидов и исследования с помощью Н-ацетазоламида свидетельствуют о непосредственном взаимодействии сульфамидов с ионами металла в активном центре [20, 21], причем координация, очеввдно, происходит за счет группы —SO2—NH2 [21, 111]. Это согласуется с результатами рентгеноструктурного анализа [22, 23] кристаллического комплекса карбоангидразы С человека с сульфамидом. Они показывают, что во внутреннюю координационную сферу цинка включена амин-ная группа сульфамида (разд. 6). По-видимому, в связывании участвуют анионная груп/пировка (—SO2— NH ) с одним протоном, замещенным на металл [30, 103]. В отсутствие конкуренции последнего величина рКа Для этой группировки колеблется от 7 до 10 (в зависимости от структуры R) [109, 115]. Некоторыми исследователями было обнаружено максимальное связывание при рН 7. В кислых и щелочных растворах прочность взаимодействия быстро падает [86, 115, 116]. Причиной распада комплекса в кислой области может являться уменьшение количества анионной формы ингибитора. [c.594]

Атом ртути ацетоксимеркурсульфаниламида находится на значительно большем расстоянии от цинка, т. е. бензольная часть сульфамида лежит в щели, ведущей к иону цинка [22]. Низкие константы диссоциации сульфамидных комплексов карбоангидразы в растворах (10- —10 М) [111—114] свидетельствуют о том, что кроме координационных имеются и другие типы связей между белком и циклической частью молекулы сульфамида. Изменения в спектрах поглощения и флуоресценции связанных сульфамидов свидетельствуют о гидрофобном характере связывающей полости [30, 103, 105]. Однако основание этой полости, расположенное вокруг атома цинка, может быть достаточно гидрофильным. [c.610]

При действии сульфамидов на карбоангидразу наблюдается кинетика ингибиро1вания как конкурентного, так и неконкурентного типа в зависимости от времени наблюдения и порядка смешивания реагентов [116—118]. Причина подобных расхождений, вероятно, кроется в чрезвычайно низкой скорости диссоциации ингибиторных комплексов, следствием чего является и малая скорость установления равновесия с конкурирующей молекулой субстрата [115, 117]. [c.595]

Из проведенного анализа становятся ясными два обстоятельства. Во-первых, все спектры характеризуются расщеплением видимых полос, что говорит о заметном искажении координационной геометрии даже в ингибированном ферменте. Во-вторых, для аппроксимации спектров этоксзол амидного комплекса (рис. 16.14, и В) требуется такое же количество гауссовских полос, что и для спектра немодифицированной Со (II)-карбоангидразы (рис. 16.14,Л). Результатом введения сильного лиганда сульфамида, по-видимому, является также смещение в коротковолновую область двух слабых полос. Однако общая мульти-плетность спектра при этом не снижается. Последнее можно объяснить строгими структурными условиями замещения лиганда (см. рентгеноструктурные данные, разд. 6). Одновременно изменяются спектры КД в ближней ультрафиолетовой области хромофоров, что особенно четко проявляется для цианидного комплекса (рис. 16.14, Г). Эти полосы также легко обнаруживаются -в спектре КД немодифицированного Со(II)-фермента (рис. 16.7 и 16.8). Специфическая геометрия координации активного центра, свойственная ей необычная серия й— -переходов (рис. 16.14,Л), а также сродство к сульфамидам являются хорощо известными особенностями белковой химии карбоангидразы. Такие же спектральные полосы имеются и у Со (II)-производных фермента, выделенного из акул, который, по-видимому, развивался по обособленному эволюционному пути за несколько сотен миллионов лет до наступления эры млекопитающих [42]. [c.597]

Карбоангидраза быка образует сильно флуоресцирующий комплекс с 5-диметиламинопафталии-1-сульфамидом (ДНСА) [103]. Исследуя усиление флуоресценции лиганда и тушение ультрафиолетовой белковой флуоресценции, Чен и Кернохан [103] показали, что с одной молекулой фермента овязывается одна молекула флуоресцирующего сульфамида. Константа диссоциации этогО комплекса равна 2,5-10 М. Флуоресценция свободного сульфамида имеет пик испускания при 580 нм и квантовый выход 0,055. Соответствующие значения для связанного ингибитора — 468 нм и 0,84. Большое смещение максимума испускания в коротковолновую область можно объяснить сильной гидрофобной природой центра связывания, а также отрывом одного протона от сульфамидной /группы лиганда при присоединении к ферменту [103]. [c.599]

Спектр ЭПР этого соединения в растворе показан на рис. 16.18, Л, а спектры его эквимолярных комплексов с различными изоферментами карбоангидразы—на рис. 16.18, , В и Г. Связывание со всеми тремя формами фермента затормаживает свободный радикал. Заторможенность несколько больше у фермента быка, что согласуется и с большей прочностью связей сульфамидов. Сравнение этого спектра с расчетными данным Ицковича [126, 134] для заторможенных свободных радикалов приводит к величине времени корреляции (т) для связанного с ферментом быка иминоксила в 2-10- —4-10- с. Интересно, что для времени вращательной релаксации, рассчитанного для комплекса той же формы карбоангидразы с флуоресцирующим сульфамидом, Чен Кернохан [103] получили значения 2,89-10- с. [c.605]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология