Получение конъюгатов

Получение конъюгатов фермент — белок [c.182]

ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛ С ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗОЙ [c.318]

Получение конъюгатов с ферментами [c.109]

В химических методах получения конъюгатов белок-фермент можно выделить две группы по типу сшивающих реагентов — гомо-бифункциональных и гетеробифункциональных. Кроме того, для получения конъюгатов белков с пероксидазой хрена широко используется пврйодатный метод. В последнее время все большее распространение получают нехимические методы синтеза конъюгатов белок-фермент, основанные на образовании иммунологической связи антиген-антитело. [c.182]

Методы получения конъюгатов [c.176]

Получение конъюгатов с помощью гомобифункциональных сшивающих реагентов. Весьма удобным в качестве сшивающего реагента оказался глутаровый альдегид, который взаимодействует с е-аминогруппами лизиновых остатков антител и фермента. Механизм реакции глутарового альдегида с белками до конца не изучен. Одновременно протекает несколько реакций, приводящих к появлению смеси продукта, содержащих более прочные химические связи, чем в простых основаниях Шиффа. Однако в общем виде схему реакций можно записать в следующем виде [c.183]

Антитела в большей части антигенов относятся к IgG-фракции иммунной сыворотки. С целью повышения чувствительности и специфичности анализа во многих случаях полезно использовать для сорбции на твердой фазе и для получения конъюгатов IgG-фракцию нативной сыворотки. Наиболее простой и доступный способ выделения IgG — метод ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе или ДЭАЭ-целлюлозе. [c.154]

ПОЛУЧЕНИЕ КОНЪЮГАТОВ АНТИТЕЛ С ПЕРОКСИДАЗОЙ [c.317]

Первым реагентом, использованным для синтеза иммуноферментных конъюгатов, был глутаровый альдегид, реагирующий с е-аминогруппами лизина белковых молекул. С помощью глутарового альдегида получены конъюгаты антител и антигенов с пероксидазой, щелочной фосфатазой, глюкозооксидазой, глюкоамилазой. Состав полученных конъюгатов можно варьировать, изменяя концентрацию альдегида и белковых компонентов. [c.109]

Нековалентные методы. Все описанные методы синтеза конъюгатов белок—фермент основаны на образовании ковалентной связи между молекулами белка и фермента. Но не менее перспективным направлением для получения конъюгатов является путь с использованием высокоспецифических иммунологических связей антиген — антитело или межмолекулярных связей белок—белок. [c.190]

В данном разделе схематично будут рассмотрены методы получения конъюгатов гаптен-носитель для иммунизации. [c.177]

Перспективным способом получения конъюгатов является метод с использованием комплекса авидин — биотин, который образуется с 10 М-> по схеме [c.191]

Кроме количества молекул гаптена, конъюгированных с носителем, важно также, через какую группу связывается гаптен с носителем. Специфичность иммуногена будет тогда выше, когда функциональные группы гаптена (антигенные детерминанты) удалены от места связывания с носителем. Этот факт необходимо учитывать, например, при получении конъюгатов стероидов с носителем. [c.177]

Получение конъюгатов-носителей с гаптенами, содержащими гидроксильную или карбонильную группу. К гаптенам этого класса относятся различные спирты, фенолы, кетоны, сахара, полисахариды, нуклеозиды, а также такие биологически важные соединения, как стероиды. Обычно эти соединения не используют непосредственно для получения конъюгатов, а превращают их в какие-либо производные, содержащие СООН-группу, которые затем конъюгируют с белками, уже описанными способами. [c.180]

Способность белка A стафилококка образовывать прочный комплекс с Рс-фрагментом антител используют для получения конъюгатов, в котором фермент, предварительно сшитый каким-либо химическим способом с белком А, соединяется с F -фрагментом антител через белковую ножку [c.191]

Интерес к изучению этого фермента в качестве маркера в ХИФА можно объяснить 1) доступностью фермента в очищенном виде 2) относительной простотой методов получения конъюгатов пероксидазы с антителами и антигенами различной структуры [c.133]

Разработка высокочувствительных и специфических методов ИФА связана с необходимостью получения конъюгатов, обладающих определенными характеристиками. [c.176]

Аминогексил- или 6-аминогексаноатсефарозу связывают с лигандом карбодиимидным методом. Высущенный материал взвешивают и погружают для набухания в раствор 0,5 М Na l (1 г = 4 мл геля). Предназначенный для связывания лиганд (белок или низкомолекулярное вещество) растворяют в воде или водном растворителе и доводят pH до 4,5. К сефарозе добавляют такой объем водного раствора гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, чтобы получилось 10 мг набухшего геля на 1 мл. Гель и карбодиимид перемешивают в течение ночи при комнатной температуре (нельзя использовать магнитную мешалку). Избыток реактивов удаляют промыванием той же смесью воды и растворителя, которая будет использована на последующем этапе связывания лиганда. Полученный конъюгат можно хранить при 4—8°С. Предназначенный для связывания лиганд растворяют в воде или смеси воды и растворителя, доводя pH водной фазы до 4,5, при этом никакого буфера не используют. Величину pH, которая снижается, главным образом в начале реакции, поддерживают на уровне 4,5, добавляя NaOH. Связанный с лигандом гель тщательно промывают связывающим раствором нет необходимости блокировать избыточные группы. После промывки в дистиллированной воде, а затем в буфере гель готов для использования в аффинной хроматографии. Материал можно хранить при pH 7,0 и температуре ниже 8°С без замораживания. [c.219]

Так как ферменты с большой молекулярной массой могут ингибировать реакцию антиген-антитело за счет стерического экранирования антигенных детерминант, в ряде случаев целесообразно использовать в качестве метки не целую молекулу фермента, а обладающий специфической активностью пептид. Такой синтез осуществляется при получении конъюгата РаЬ-фрагмента с гемоктапептидом, имеющим пероксидазную активность. [c.110]

Антигенная специфичность гаптенов зависит не только от их химической структуры, но и от способа пришивки к белку-носителю, в частности от того, какая функциональная группа гаптена была использована для конъюгирования. Часто, при получении конъюгатов для иммунизации гаптены пришивают не непосредственно к молекуле белка-носителя, а через пространственную ножку , содержащую обычно 4—6 углеродных атомов. В этом случае сама ножка в комплексе с гаптеном выступает в качестве составной антигенной детерминанты и образующиеся антитела могут обладать меньшей эффективностью связывания с нативным гаптеном, чем с таким связанным через ножку гаптеном. [c.16]

Получение конъюгатов гаптен — фермент [c.192]

Синтез конъюгатов гаптенов с ферментами основаны в принципе на тех же методах, что и синтез конъюгатов белков с ферментами. Однако есть ряд особенностей, которые необходимо учитывать при проведении синтезов. Во-первых, многие гаптены плохо растворимы в водных растворах и поэтому получение конъюгатов приходится проводить в водно-органической среде, что сказывается на ферментативной активности конъюгата. Во-вторых, бывает очень сложно очистить конъюгат от свободного фермента, а это приводит к высоким фоновым реакциям, а поэтому синтез должен быть выполнен с высоким выходом. В-третьих, для сохранения иммуногенных свойств гаптен должен быть пришит к ферменту через углеводородную ножку , содержащую 5—6 атомов цепи. [c.192]

Известно большое количество методов для получения конъюгатов с лЧоминолом. Часть методов вк яючает стадию образования активных альдегидных групп при окислении углеводных остатков и гаптенов перйодатом натрия. Активные альдегидные группы на молекуле белка реагируют с ароматической аминогруппой с обр-а-зованием основания Шиффа. Для ковалентного связывания люминола с модифицированными белками и гаптенами используют также глутаровый альдегид и карбодимиды. [c.139]

Для получения конъюгата антител с пероксидазой хрена используют антивидовые антитела к ферменту, которые образуют так называемый иммунопероксидазный комплекс (пероксидаза—антитела [c.190]

Процесс получения конъюгатов стероидов с хемилюминесцент-ным маркером включает два основных этапа 1) модификацию стероида — введение в молекулу стероида карбонильной группы, ее активацию в присутствии карбодиимида и М-Оксисукцинимида с образованием активированного эфира 2) реакцию активированного эфира стероида с аминогруппой производного изолюминола [c.141]

Химическая модификация молекулы антитела при получении конъюгатов в некоторых случаях может приводить к уменьшению констант связывания в 10 раз и более. Это послужило одним из стимулов для получения гибридных моноклональных антител, содержащих два различных антигеновязываюш,их центра, один из которых направлен к определенному антигену, а другой — к ферменту, используемому в качестве метки. Можно ожидать, что гибридные моноклональные антитела окажутся ценным терапевтическим средством, поскольку одновременно позволяют вводить в организм лекарственные соединения и осуществлять их направленный транспорт. [c.166]

Перйодатный метод (метод Накане). Этот метод был впервые предложен японскими исследователями Накане и Каваои (1974) и с тех пор наиболее употребим для получения конъюгатов антител или белков с пероксидазой хрена. Суть метода состоит в модификации пероксидазы хрена с образованием активных альдегидных групп, которые затем реагируют с аминогруппами антител с образованием основания Шиффа. Альдегидные группы в пероксидазе возникают при окислении перйодатом натрия углеводных компонентов фермента, аминогруппы которого предварительно или блокированы I-фтор-2,4-динитробензолом или протонированы [c.182]

Получение конъюгатов-носителей с гаптенами, содерж ими карбоксильную группу. Наиболее широко распространен метод сме-шанных ангидридов, который состоит в простом эквимОлярном смешивании гаптена (Г) и БСА (Б) с изобутилхлорформиатом и основанием (N-метилморфолин, трибутиламин, триэтиламин) [c.178]

Получение конъюгатов-носителей с гаптенами, содержащими аминогруппу. Гаптены с доступной для модификации аминогруппой можно разделить на две группы по способам их конъюгирова- [c.179]

Известно несколько примеров получения конъюгатов IgG с пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, глюкозооксидазой и р-/)-галактозидазой с применением в качестве гомобифункциональ-ного сшивающего реагента п-бензохинона. Метод основан на реакции п-бензохинона с амино- и тиогруппами белка, скорость которой зависит от pH. Благодаря этому был разработан двухстадийный способ получения конъюгатов, когда п-бензохиноновое производное белка получают при pH б, выделяют, а затем смешивают с другим белком при pH 8. Одна из возможных схем реакции следующая [c.185]

Реакция протекает по гистидиновому, тирозиновому или трипто-фановому остаткам белка-носителя. Для гаптенов, содержащих ароматические нитрогруппы, например хлорамфеникол, используют этот же метод получения конъюгатов, причем в данном случае нитрогруппу гаптена предварительно восстанавливают до аминогруппы. [c.180]

Для получения конъюгатов антител или их фрагментов с р-Д-га-лактозидазой применяется М, И -о-фенилендималеимид — гомоби-функциональный сшивающий реагент, содержащий две малеимид-ные группы [c.185]

Однако дималеимидный метод может быть применен для получения конъюгатов и с другими белками. SH-группы могут быть введены в молекулы белков несколькими методами, в том числе путем частичного восстановления дисульфидных связей 2-меркаптоэтила-мином [c.185]