Получение конъюгатов с ферментами

Получение конъюгатов фермент — белок [c.182]

В химических методах получения конъюгатов белок-фермент можно выделить две группы по типу сшивающих реагентов — гомо-бифункциональных и гетеробифункциональных. Кроме того, для получения конъюгатов белков с пероксидазой хрена широко используется пврйодатный метод. В последнее время все большее распространение получают нехимические методы синтеза конъюгатов белок-фермент, основанные на образовании иммунологической связи антиген-антитело. [c.182]

Получение конъюгатов с помощью гомобифункциональных сшивающих реагентов. Весьма удобным в качестве сшивающего реагента оказался глутаровый альдегид, который взаимодействует с е-аминогруппами лизиновых остатков антител и фермента. Механизм реакции глутарового альдегида с белками до конца не изучен. Одновременно протекает несколько реакций, приводящих к появлению смеси продукта, содержащих более прочные химические связи, чем в простых основаниях Шиффа. Однако в общем виде схему реакций можно записать в следующем виде [c.183]

Получение конъюгатов с ферментами [c.109]

Нековалентные методы. Все описанные методы синтеза конъюгатов белок—фермент основаны на образовании ковалентной связи между молекулами белка и фермента. Но не менее перспективным направлением для получения конъюгатов является путь с использованием высокоспецифических иммунологических связей антиген — антитело или межмолекулярных связей белок—белок. [c.190]

Способность белка A стафилококка образовывать прочный комплекс с Рс-фрагментом антител используют для получения конъюгатов, в котором фермент, предварительно сшитый каким-либо химическим способом с белком А, соединяется с F -фрагментом антител через белковую ножку [c.191]

Интерес к изучению этого фермента в качестве маркера в ХИФА можно объяснить 1) доступностью фермента в очищенном виде 2) относительной простотой методов получения конъюгатов пероксидазы с антителами и антигенами различной структуры [c.133]

Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими карбоксильную группу. Самыми распространенными методами син- [c.192]

Так как ферменты с большой молекулярной массой могут ингибировать реакцию антиген-антитело за счет стерического экранирования антигенных детерминант, в ряде случаев целесообразно использовать в качестве метки не целую молекулу фермента, а обладающий специфической активностью пептид. Такой синтез осуществляется при получении конъюгата РаЬ-фрагмента с гемоктапептидом, имеющим пероксидазную активность. [c.110]

Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими углеводные остатки. Такие гаптены, как дигоксин, аденозин и другие, имеющие в своей структуре углеводные группировки, могут быть легко конъюгированы с ферментами путем их окисления перйодатом натрия до производных с альдегидной группой и последующим взаимодействием с ЫНг-группами фермента [c.196]

Для получения конъюгата антител с пероксидазой хрена используют антивидовые антитела к ферменту, которые образуют так называемый иммунопероксидазный комплекс (пероксидаза—антитела [c.190]

Получение конъюгатов гаптен — фермент [c.192]

Синтез конъюгатов гаптенов с ферментами основаны в принципе на тех же методах, что и синтез конъюгатов белков с ферментами. Однако есть ряд особенностей, которые необходимо учитывать при проведении синтезов. Во-первых, многие гаптены плохо растворимы в водных растворах и поэтому получение конъюгатов приходится проводить в водно-органической среде, что сказывается на ферментативной активности конъюгата. Во-вторых, бывает очень сложно очистить конъюгат от свободного фермента, а это приводит к высоким фоновым реакциям, а поэтому синтез должен быть выполнен с высоким выходом. В-третьих, для сохранения иммуногенных свойств гаптен должен быть пришит к ферменту через углеводородную ножку , содержащую 5—6 атомов цепи. [c.192]

Приготовление конъюгатов ЩГС-МБ— -галактозидаза и [К-МБ— -галактозидаза ]. Присоединение КГС-МБ или К-МБ к i-галактозидазе в 0,05 М фосфатном буфере, pH 7,0 (буфер А), и очистку конъюгата [фермент-гаптен] на колонке с сефадексом G-25 проводили аналогично процессу получения и очистки конъюгата [Т4— -галактозидаза]. [c.267]

Получение конъюгатов ферментов с гаптенами, содержащими аминогруппы. Метод с применением гомобифункциональных сшивающих реагентов. Самый простой способ получения конъюга- [c.194]

Получение конъюгата [фермент — гаптен]. Присоединение ДСА-МБ к -галактозидазе осуществляют так же, как это описано для Т4 в разделе, посвященном ИФА Т4. К 1,5 мл 0,5 М фосфатного буфера, pH 7,0, содержащего 0,5 мг -галактозидазы (0,93 нмоль), добавляют раствор ДСА-МБ ТГФ (0,2 мг/мл, 10 нмоль). Смесь инкубируют 2 ч при комнатной температуре. После диализа в течение ночи против того же фосфатного буфера смесь очищают хроматографией на колонке (1,5x40 см) с сефадексом G-25. Для анализа дигоксина используют фракции с максимальной ферментативной активностью. [c.269]

Перйодатный метод (метод Накане). Этот метод был впервые предложен японскими исследователями Накане и Каваои (1974) и с тех пор наиболее употребим для получения конъюгатов антител или белков с пероксидазой хрена. Суть метода состоит в модификации пероксидазы хрена с образованием активных альдегидных групп, которые затем реагируют с аминогруппами антител с образованием основания Шиффа. Альдегидные группы в пероксидазе возникают при окислении перйодатом натрия углеводных компонентов фермента, аминогруппы которого предварительно или блокированы I-фтор-2,4-динитробензолом или протонированы [c.182]

Получение фрагментов антител. При разработке некоторых модификаций ИФА может возникнуть необходимость использования конъюгатов фермента не с целой молекулой иммуноглобулина, а с тем ее фрагментом, который специфически связывается с молекулой антигена —Fab-фрагментом. Обусловлено это прежде всего тем, что рс-фрагмент молекулы, ответственный за эффек-торные функции иммуноглобулина, обладает способностью неспецифически взаимодействовать с другими белками, сорбированными на носителях при проведении твердофазного ИФА. Эффект неспецифической сорбции определяется природой антигена, концентрацией сорбированного на носителе белка и рядом других факторов. [c.155]

Химическая модификация молекулы антитела при получении конъюгатов в некоторых случаях может приводить к уменьшению констант связывания в 10 раз и более. Это послужило одним из стимулов для получения гибридных моноклональных антител, содержащих два различных антигеновязываюш,их центра, один из которых направлен к определенному антигену, а другой — к ферменту, используемому в качестве метки. Можно ожидать, что гибридные моноклональные антитела окажутся ценным терапевтическим средством, поскольку одновременно позволяют вводить в организм лекарственные соединения и осуществлять их направленный транспорт. [c.166]

Кроме того, должно быть тщательно выбрано место прищивки гаптена к ферменту, так как это влияет на специфичность анализа. Показано, что специфичность анализа для гаптенов выше, если конъюгат фермент—гаптен получен способом, отличным от метода синтеза конъюгата гаптен-носитель, используемым для иммунизации. [c.192]

Если при получении конъюгатов гаптен-носитель для иммунизации животных стараются пришить 10 молекул гаптена на молекулу белка, то конъюгат гаптен—фермент должен отвечать составу 1 1. Поэтому для синтеза конъюгатов гаптен—фермент в настоящее время в основном используют методы с применением гетеробифункциональных реагентов. [c.192]

Что касается преодоления проблем коротких замыканий то здесь метод a-ELISA имеет два основных преимущества 1) сам ИФК обладает иммунологическим сродством только к фосфатазе, но не к иммуноглобулинам каких-либо других видов, что весьма обычно для традиционных конъюгатов, и 2) изоти-пическую специфичность антиглобулинов можно определять без предварительного получения конъюгатов тестируемых антител с ферментом. [c.217]

Хотя, строго говоря, метод ИААК должен быть отнесен к классу гетерогенных ИФА, этап разделения связанных и свободных реагентов в этом методе осуществляется настолько просто и быстро (особенно при использовании соответствующего оборудования), что позволяет сопоставить его с современными вариантами гомогенного анализа. Время инкубации после добавления к образцу препарата моновалентных антител, конъюгированных с ферментом, определяется главным образом концентрациями антител и антигена, поскольку их взаимодействие в данном случае представляет собой простую обратимую бимолекулярную реакцию, зависящую только от диффузии. В табл. 15-1 представлены результаты расчета скорости взаимодействия антиген — антитело в зависимости от их относительного содержания в реакционной смеси. Единственным допущением при расчетах является величина константы скорости прямой реакции ЫО л моль -с выбранная на основании данных, полученных для большинства исследованных систем взаимодействия небольших антигенов с антителами (Pe ht, 19 2). Из расчетных данных табл. 15-1 следует, что даже для определения тестируемого компонента, концентрация которого не превышает пикомолярного уровня, использование большого избытка конъюгата [фермент—антитело] (на наномолярном уровне) позволяет ожидать быстрого количественного связывания и завершения анализа не более чем за 5—10 мин. Кривая, построенная на основании изучения кинетики связывания дигоксина с мономерным конъюгатом [Fab — -галактозидаза] (рис. 15-2), подтверждает справедливость расчетных оценок. Концентрации дигоксина и конъюгата в этих экспериментах составляли 0,2 нМ и 10 нМ соответственно. Как видно на ри- [c.249]

В случае ИФА кортизола для конъюгации гаптена с сульфгидрильными группами -галактозидазы были синтезированы производные кортизола — КГС-МБ и К-МБ. С целью сравнения нашего метода конъюгации с разработанными ранее мы проводили также связывание КГС с аминогруппами -ra-лактозидазы методом смешанных ангидридов. Сравнение полученных конъюгатов проводили методом осаждения вторыми антителами при избытке антител против кортизола. Установлено, что при использовании метода смешанных ангидридов метится только 40% молекул фермента, при этом ферментативная активность снижается на 20%. При использовании разработанного нами метода конъюгации с производными гаптена без заметного снижения ферментативной активности метится более 95% фермента (табл. 17-1). Число молей КГС-МБ или К-МБ, связанных с ферментом, непосредственно не определяли. Однако, как и в случае конъюгата [Т4 — фермент], можно счн тать, что с каждой. молекулой -галактозидазы связывается до 12 молекул гаптена. Изучали также иммунологическую активность и специфичность взаимодействия конъюгатов [гаптен — фермент] с антисывороткой против кортизола. Конъюгаты типа [КГС— ,-гaлaктoзидaзa] и [КГС-МБ— -гаЛактозидаза] обладают высокой иммунологической активностью, но лишь в незначительной степени вытесняются из комплекса с антителами [c.271]

Конъюгат [антитело — щелочная фосфатаза], содержащийся в избытке, катализирует образование окрашенного продукта прямо пропорционально концентрации фермента, причем эта зависимость, по-видимому, сохраняется и при А405>2 ед., где уже оптическую плотность нельзя надежно измерить. Для расширения концентрационного диапазона (в рамках сохранения линейности) можно попытаться измерять оптическую плотность при длине волны, соответствующей меньшей экстинкции (Saunders et al., 1984). Максимум поглощения для л-нитрофенола соответствует Х=405 нм. При Я,=450 нм экстинкция л-нитро-фенола составляет примерно одну пятую экстинкции в максимуме. Это означает, что, проводя измерения при двух длинах волн — 405 и 450 нм, можно в пять раз поднять допустимый верхний предел концентрации тестируемого компонента. При работе с обычным спектрофотометром это связано с необходимостью постоянного переключения длины волны с 405 на 450 нм для каждого образца. В то же время на фотометре со сменными фильтрами, рассчитанном на несколько длин волн и управляемом микропроцессором, можно делать то же самое в автоматическом режиме. Сравнивая значения поглощения, полученные при двух длинах волн, процессор может выбирать одно из них, более подходящее для расчета концентрации образца. По-стройшая таким образом система обеспечивает высокую чувствительность благодаря измерениям в максимуме и в то же время позволяет одновременно расширить концентрационный диапазон за счет дополнительных измерений при длине волны, соответствующей меньшей экстинкции. Существенно помнить, что чувствительность ферментативного иммунометрического анализа практически полностью определяется удельной ферментативной активностью конъюгата [фермент — антитело]. В связи с этим любое повышение удельной активности конъюгата, не сопровождающееся усилением его неспецифического связывания, будет приводить к повышению чувствительности, т. е. к снижению минимального значения концентрации тестируемого компонента, поддающегося определению данным методом анализа. [c.392]

Ферментативная активность полученных конъюгатов по отношению к низкомолекулярным субстратам оказалась близкой к активности исходного фермента, устойчивость к термоинактивации и аутолизу была повышена, а способность к взаимодействию с высокомолекулярным ингибитором — снижена. Таким [c.170]

Свойства ферментов, связанных с полианионными носителями, зависят от характера носителя и условий получения конъюгата (количества конденсирующего агента, носителя и фермента). Так, при взаимодействии а-химотрипсина с полианионами (полиакриловой и поли-Ь-глутаминовой кислотами или карбоксиметилцеллюлозой) под действием реагента Вудворда К активность растворимого конъюгата возрастает с уменьшением количества конденсирующего реагента [31]. Поскольку при этом степень связывания фермента практически не уменьшается, то для достижения максимальной активности достаточно, по-видимому, одноточечного связывания образование же последующих связей снижает активность. [c.172]

Особо следует отметить работы тех же авторов по полимерным производным стрептокиназы с полисахаридными носителями [64, 65]. Полученные конъюгаты эффективно разрушают искусственные тромбы, а конъюгат на основе диальдегиддск-страна ( Стрептодеказа ) — первый в мире полимерный препарат фермента, который разрешен для клинического применения и показал хорошие результаты [66]. Среди других полимерных конъюгатов протеолитических ферментов, обладающих тромбо-литическими свойствами, конъюгаты урокиназы [65, 67]. [c.180]

Среди конъюгатов ферментов с декстраном, полученным иными, чем приведенные выше, методами, можно отметить конъюгаты нуклеаз, синтезированных алкилированием полисахарида л1-нитробензилоксиметилпиридинием с последующим восстановлением нитрогрупп, диазотированием и азосочетанием с белком [70]. Конъюгаты такого типа существенно стабильнее исходных ферментов как при хранении, так и при внутрибрю-шинном введении животным. [c.181]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология