Гель-фильтрация гликопротеинов

Для получения в индивидуальном состоянии смешанных биополимеров наиболее эффективными методами разделения являются хроматография (ионообменная хроматография и гель-фильтрация для гликопротеинов, адсорбционная хроматография для гликолипидов) и электрофорез во многих случаях успешно применяются методы фракционированного осаждения. [c.566]

Возможности этих методов ограничиваются только пригодностью изучаемых гликопротеинов для фракционирования на колонках. Автор нашел, что некоторые эпителиальные гликонротеины очень прочно прилипают к ионообменной целлюлозе и к большинству других хроматографических наполнителей. Многие эпителиальные гликопротеины хотя обычно и ведут себя нормально при гель-фильтрации, но, как уже отмечалось, имеют столь большие эффективные размеры молекул, что совершенно не удерживаются большинством крупнопористых гелей. Но даже и при этих обстоятельствах гель-фильтрация будет обнаруживать более низкомолекулярные примеси. Гель-фильтрация и ионообменные методы используются препаративно нет необходимости снова проверять материал, полученный в качестве единственного компонента при таком фракционировании, за исключение г тех случаев, когда нужно убедиться, что материал не подвергся деградации. [c.51]

Эффективность применения моноклональных антител может быть продемонстрирована на примере выделения общего лейкоцитарного антигена (L- -антигена) тимоцитов крысы [7]. На первом этапе с помощью аффинной хроматографии на иммобилизованном лектине чечевицы и гель-фильтрации в присутствии дезоксихолата получают частично очищенный препарат мембранного гликопротеина тимоцитов с молекулярной массой [c.188]

Влияние присутствия углеводных компонентов на свойства белковой молекулы зависит от их содержания, которое варьирует в широких пределах от <1% до >80%. Присоединение к пептидной цепи среднего размера одной или двух небольших олигосахаридных цепей, почти никак не сказывается на типично белковых свойствах соединений. В то же время гликопротеины с высоким содержанием сахаров фактически ведут себя как полисахариды. Большинство гликопротеинов, однако, характеризуется содержанием углеводов, средним между этими двумя экстремальными случаями. Любой белок может быть заподозрен в своей принадлежности к гликопротеинам, особенно в случае аномального поведения при гель-фильтрации, ультра-центрифугировании, окрашивании, измерении ультрафиолетового поглощения и т. д. [c.317]

Для разрушения пептидной части гликопротеинов широко применяется протеолиз, особенно часто под действием проназы (обычно из 81гер1от св5 г15тч), которая является набором мощных протеиназ, способных разрушать пептидные цепи, устойчивые к другим протеолитиче-ским ферментам. Часто употребляются также трипсин, химотрипсин, па-паин. Гидролизат, полученный после обработки протеиназами, подвергают фракционированию с применением диализа, гель-фильтрации и хроматографии (см., например, ), выделяя один или несколько низкомолекулярных гликопептидов, структуру которых устанавливают обычными методами и иногда подтверждают встречным синтезом. Впервые гидролиз гликопротеина трипсином был применен Нейбергером для выделения фрагмента овальбумина, содержащего узел связи олигосахаридной и пептидной части молекулы в дальнейшем для этой же цели использовали также химотрипсин, пепсин и другие фepмeнты " . . Протеолиз проназой очень широко применялся при выделении узловых фрагментов из 7-глобулина , тиреоглобулина фибриногена и особенно му- [c.571]

Сиаловые кислоты, входящие в состав гликонротеинов, защищают их от действия протеолитических ферментов, поэтому необходимо предварительно отщепить их нейраминидазой. После удаления сиаловых кислот гликопротеины частично расщепляются протеолитическими ферментами (папаин, проназа) на гликопептиды, доступные для дальнейшего исследования. Гликопептиды затем обрабатывают ферментами, отщепляющими аминокислоты (например, карбоксипептидазой после защиты конечной аминогруппы), и превращают в олигосахариды, содержащие только одну аминокислоту. Углеводные компоненты гликапро-теинов, имеющих щелочелабильную связь углевод—аминокислота, отщепляют щелочной обработкой или ферментами, разрушающими связи такого типа. Полученные таким образом гетеросахариды или гетеросахариды с одной аминокислотой очищают от примесей пептидов и аминокислот переосаждением из водноорганических смесей (вода-спирт, вода—ацетон), экстракцией фенолом, хроматографией, электрофорезом или гель-фильтрацией. [c.76]

Принципы и техника электрофореза не требуют специального описания [14—16]. Обнаружение одиночного пика при двух или трех достаточно далеких значениях pH является признаком гомогенности. Применение для этой цели интерференционной онтики менее удовлетворительно, несмотря на ее высокую чувствительность, поскольку полученная кривая требует дифференцирования. Электрофоретическая подвижность зависит как от заряда молекулы, так и от гидродинамического сопротивления, причем оба эти фактора независимы. Они могут компенсироваться, давая в результате одинаковую подвижность для двух физически совершенно различных молекул, по это не может происходить при различных значениях pH. Поэтому важно проверить устойчивость гликопротеина в изучаемом интервале pH многие гликонротеины неустойчивы, особенно при высоких pH [17—19]. Полезная дополнительная информация может быть получена, если гликопротеин содержит заметные количества концевой сиаловой кислоты. В таких случаях заряд молекулы онределяется главным образом этим компонентом, и в большинстве случаев сиаловую кислоту можно почти полностью удалить с помош ью нейраминидазы. Если используемое количество фермента таково, что его можно обнаружить при последуюш,ем электрофоретическом анализе, фермент лучше сначала удалить, если это можно сделать удобным способом. Часто для этого пригодна гель-фильтрация. Молекулярный вес нейраминидазы холерного вибриона составляет около 9 -10 (Лэйвер [20]). Если после обработки нейраминидазой наблюдается два или более электрофоретически различных компонента вместо одного, наблюдавшегося перед обработкой, это значит, что материал, несмотря на его электрофоретическую гомогенность, содержит молекулы, различающиеся по химической природе остатков, от которых зависит заряд молекулы. Эта процедура может повысить степень полидисперсности, если реакция пе доведена до конца, но она не будет превращать гомогенные препараты в гетерогенные. Очевидно, важно убедиться, что используемая нейраминидаза не обладает никакой иной ферментативной активностью, особенно протеолитической. Описаны методы получения нейраминидазы необходимой чистоты [21, 22]. Проверке по этому способу был подвергнут а1-кислый гликопротеин человека [23], после обработки нейраминидазой наблюдалось два электрофоретических ника, несмотря на кажущуюся гомогенность необработанного материала в широком интервале рЬ1. [c.45]

Разделение путем гель-фильтрации на колонках с агаром или сефадек-сом [47] дает наилучпше результаты, если величина пор геля выбрана так, что гликопротеин движется со скоростью, средней между скоростью материала, совершенно не проникающего в гель, и скоростью материала, легко диффундирующего в гель. Ионообменная целлюлоза дает наилучшее разделение при медленно изменяющемся градиенте pH и (или) ионной силы [48, 49]. В обоих случаях важно удостовериться, что практически весь нанесенный на колонку материал вышел с элюатом. Нужно тщательно подобрать условия, чтобы быть уверенным, что pH, ионная сила и размеры колонки являются нодходящилш, В лаборатории автора для анализа образцов, содержащих 0,5—50 мг материала, используют колонки размером 75 X 2,5 см, элюат из которых собирают фракциями объемом 3 мл. [c.50]

Как правило, уже иа стадии выделения и очистки гликопротеина и определения его гомогенности исследователь, наблюдая поведение вещества в ходе соответствующих операций, может составить некоторое представление о молекулярном весе гликонротеина и нолучить самые предварительные сведения о форме его молекул. Так, например, обычно становится известным, являются ли растворы гликонротеина высоковязкими или нет, а также зависит ли в заметной степени их вязкость от ионной силы. Как правило, становится ясным, способен ли данный гликопротеин к денатурации, а также выясняется его поведение нри гель-фильтрации на колонках. Определение содержания в препарате сиаловой кислоты и сульфатных групп показывает, насколько сильно заряжены его молекулы. После выяснения этого вопроса необходимо решить, достаточно ли велик этот заряд, чтобы возникала необходимость в применении специальной обработки. Вообще [c.95]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология