Гликопротеины гидролиз кислотный

Моносахариды, участвующие в связи, также можно легко идентифицировать. По-видимому, углеводные фрагменты гликопротеипов всегда имеют разветвленную структуру, за исключением тех случаев, когда они очень малы, как, например, дисахарид, найденный в гликопротеинах подчелюстных желез. Циклические олигосахариды, подобные декстринам Шардин-рера, в качестве простетических групп не встречаются. При выделении гетерополисахарида в состоянии, когда он не содержит никаких аминокислот, его восстанавливающая группа оказывается свободной, что позволяет предполагать, что это именно та группа, через которую осуществлялась связь углеводной и пептидной цепей. В случаях, когда эта связь относительно чувствительна к щелочи, как это наблюдается в гликопротеинах, где она осуществляется через остатки серина и (или) треонина, она может быть расщеплена в тщательно контролируемых условиях, и сахар, образующий связь, может быть идентифицирован стандартными методами после окисления в гликоновую кислоту или восстановления в многоатомный спирт. Однако, если сахар, образующий связь, сам замещен сахарным остатком в положении 3, могут возникнуть трудности этот вопрос обсуждался выше (см. стр. 266). В таких сучаях более плодотворным подходом может оказаться частичный кислотный гидролиз. [c.279]

Определение структуры гликопротеинов требует (как и в случае других молекул) их предварительной очистки, которая может быть достигнута с помощью методов, обычно применяемых для белка. Для очистки некоторых гликопротеинов оказалось весьма плодотворным также применение аффинных колонок с лектинами (см. ниже). Углеводный состав гликопротеинов определяли после кислотного гидролиза при помощи газожидкостной хроматографии—масс-спектрометрии (ГЖХ—МС). Для изучения детальной структуры олигосахаридных цепей было опробовано множество различных методов. Наиболее эффективной оказалась комбинация ГЖХ—МС и ЯМР-спектрометрии с высоким разрешением. Особенности связей между сахарами в гликопротеинах (рассмотрение которых не входит в задачу данной главы) имеют фундаментальное значение для структуры и функций этих молекул. [c.300]

Прежде полагали, что многие биополимеры, например из эритроцитов крови человека или слизистых выделений, являются белками, а обнаруживаемые вместе с ними углеводы являются примесью. Однако в 1865 г. при элементном анализе очищенного муцина [3] было установлено, что содержание в нем углерода и азота значительно меньше, чем должно быть в случае белка. При кислотном гидролизе муцина был выделен продукт, который оказался глюкозой. Постепенно стало ясно, что существует ряд природных макромолекул (гликопротеинов), в которых углеводы составляют часть общей структуры. Трудность отделения углеводных молекул от белка без их разрушения (за исключением гликоз-аминогликанов) и тот факт, что гетерополисахариды, присутствующие в одном образце гликопротеина, часто неидентичны, но [c.214]

Второй гликопротеин куриного белка — овомукоид имеет молекулярный вес примерно 28 ООО и содержит около 20% углеводов, в числе которых находится манноза, галактоза, глюкозамин и небольшие количества N-ацетилнейраминовой кислоты. Считается наиболее вероятным, что овомукоид содержит три одинаковые или близкие по структуре олигосахаридные цепи , из которых для одной однозначно доказана гликопеп-тидная связь ацилгликозиламидного типа через аспарагиновую кислоту и N-ацетилглюкозамин. Высказано предположение, что другие связи могут быть О-гликозидными . Строение углеводных цепей- овомукоида еще не установлено, однако в результате протеолиза и частичного кислотного гидролиза выделено несколько гликопептидов. По имеющимся данным, углеводная цепь овомукоида содержит галактозу, маннозу и глюкозамин в соотношении 1 4 8. Распад по Смиту показывает, что концевыми остатками являются галактоза и манноза олигосахаридные цепи гликопротеина, по-видимому, сильно разветвлены . [c.576]

Как правило, любому типу анализа альдоз предшествует кислотный гидролиз. Условия гидролиза подбирают с таким расчетом, чтобы деградация образующихся сахаров была минимальной [5, 8]. Структуру некоторых типов углеводсодержащих соединений, например гликопротеинов и полисахаридов, изучают на основании данных частичного кислотного гидролиза [5]. Этот метод не только позволяет получить максимальный выход каждой альдозы, но и дает дополнительную информацию о последовательности моносахаридных остатков и о характере гликозидных связей. [c.24]

Из аорты человека выделено соединение, состоящее гепарина и белка, которое содержит ковалентную связь и является гликопротеином . После обработки его гиалуронидазой и протеиназами , а также в результате мягкого кислотного гидролиза получены низкомолекулярные гликопептиды 0-ксилозид серина и галактозилксилозид серина , что непосредственно доказывает природу одного из типов связи гепарина с пептидной цепью бглка в гепарин-белковом комплексе. Структура кси-лозида серина была подтверждена встречным синтезом . Таким образом, в настоящее время наличие ковалентной связи между белковой частью и углеводами соединительной ткани можно считать строго доказанным. [c.580]

В этот первый период исследования гликопротеинов были описаны их растворимость, вязкость и поведение по отношению к кислотам и щелочам. Почти не оставалось сомнений в том, что гликопротеины содержат прочно связанное с белковой частью вещество, которое содержит азот и после кислотного гидролиза проявляет восстанавливающие свойства. Однако не было выполнено ни элементарного анализа восстанавливающего вещества, ни получено более точных сведений о его природе. Отнесение его к классу углеводов основывалось только на восстанавливающих свойствах. Так как химики прошлого века уже знали, что восстанавливающие свойства присущи не только сахарам, оставалась известная неопределенность в толковании полученных результатов, отмеченная, нанример, Дрекселем [25]. [c.12]

Для установления количественного состава входящих в гликопротеин моносахаридов и аминокислот биополимер подвергают полному кислотному гидролизу, и состав гидролизата определяют обычными методами количественного анализа. Пептидные связи устойчивее гликозидных по отношению к кислотам, поэтому для полного расщепления на мономеры гликопротеины приходится гидролизовать в более жестких условиях, чем обычные полисахариды (6 н. НС1, 100—ПО °С, 24 ч) . Нужно иметь в виду, что как сахара, так и аминокислоты могут частично распадаться в условиях кислотного гидролиза, причем в ряде случаев можно с помощью ХОЛОСТЫХ опытов внести соответствующие поправки при анализе. Специфической для гликопептидов побочной реакцией в условиях кислотного гидролиза является возможная конденсация сахаров с аминокислотами, приводящая к окрашенной сложной смеси различных веществ, в том числе простейших карбонильных соединений (так называемая реакция Майяоа). Например, по данным Готшалка , потеря аминокислот при кислотном гидролизе богатых сахарами гликопротеинов может составлять до 30 %. Количественное определение моносахаридов проводят с использованием хроматографии, спектрофотометрической и колориметрической техники (см. гл. 14). Для анализа аминокислот применяют обычно методы, хорошо известные из химии белка. Так, количественный анализ аминокислотного состава проводят в автоматических анализаторах или с помощью газо-жидкостной хроматографии . [c.567]

В настоящее время для освобождения сахаров из гликопротеинов применяется почти исключительно гидролиз кислотами, так как гликозидные связи обычно устойчивы к действию щелочи (см. однако, [1]). Кислотный гидролиз представляет наиболее трудную проблему углеводного анализа гликонротеинов будет интересно сравнить эту ситуацию с проблемой аминокислотного анализа белков вообще. Кроме триптофана, все обычно встречающиеся в белках аминокислоты выдерживают применяемые условия гидролиза (приблизительно б н. соляная кислота при 100—110°) или полностью, или с небольшой степенью разрушения, которую, как правило, можно учесть, как в случае серина и треонина (см. гл. 5). Проводя гидролиз в течение различного времени, можно ввести точные поправки на потери двух упомянутых аминокислот, и затем в жестких условиях расщепить все пептидные связи. При анализе углеводных остатков в гликопротеинах положение резко изменяется. [c.195]

В гликопротеинах гликозидная связь осуществляется либо за счет гидроксильных групп боковых групп, либо с участием азота аспарагина, хотя известен один пример 5-замещения в белке мочи, из которого был выделен дигалактозилцистеин [14]. Однако во всех случаях углевод теряется при мягком кислотном гидролизе. Лучшим является способ, когда кислотному гидролизу предшествует ферментативное удаление углеводных остатков, так как присутствие последних может приводить к деструкции аминокислот в процессе гидролиза. [c.232]

Определение сахаров в гликонротеине нуждается в подходе, несколько отличающемся от того, который используется при анализе аминокислотного состава белков. Во-первых, все методики количественного определения данного сахара требуют освобонедения моносахарида из его глпкозида либо в отдельной предварительной стадии, либо в общей части используемой аналитической процедуры. Это объясняется тем фактом, что, вообще говоря, единственными функциональными группами, присутствующими в углеводной части гликопротеинов и обнаруживаемыми физическими или химическими методами до гидролиза, являются гидроксильные группы, общие для всех типов сахаров. Конечно, имеются также карбоксильные группы сиаловых кислот, обусловливающие сильно кислотный характер гликопротеинов, содержащих остатки сиаловых кислот. С другой стороны, боковые цепи аминокислотных остатков обычно свободны, сильно отличаются по структуре и реакционной способности и многие из них могут быть обнаружены и определены количественно физическими или химическими методами. Так, измерение поглощения в ультрафиолете применяется для определения тирозина и триптофана с помощью специальных методик можно отличить цистеин от цистина, а аргинин и гистидин можно определить колориметрическими методами, причем все это выполняется на интактном белке. [c.195]

Прямых экспериментальных методов для решения вопроса об общем типе построения сложных гликопротеинов еще не разработано. Однако недавно предложен новый подход к этой прсблеме . Он состоит в том, что гликопротеин подвергают неизбирательной деструкции, скажем кислотному или щелочному гидролизу, и наблюдают ход этой деструкции, анализируя через определенные промежутки времени мономерный состав сохраняющегося высокомолекулярного фрагмента и низкомолекулярных фрагментов, отщепившихся при деструкции. При этом, естественно, в первую очередь разрываются связи, наиболее лабильные к данному воздействию. Выбирая реагент, действующий преимущественно на пептидные или гликозидные связи, и изучая состав получающихся при деструкции фрагментов, молено сделать вывод о том, как глубоко проходит деструкция полимера при разрыве пептидных и полисахаридных цепей и, следовательно, лежит ли в основе молекулы пептидная цепь (тип III), полисахэ- [c.569]

Частичный кислотный гидролиз, проводимый обычно разбавленными минеральными кислотами на холоду или при нагревании, приводит к разрыву гликозидных связей и отщеплению углеводных фрагментов пептидные цепи в этих условиях, как правило, устойчивы. Этим путем трудно получить мелкие гликопептиды, содержащие узловую гликопептидную связь, однако метод имеет важное значение для получения олигосахаридных фрагментов гликопротеинов. Кислотный гидролиз сыграл важную роль при изучении групповых веществ крови Этот метод не специфичен, хотя в отдельных случаях удается осуществить преимущественный разрыв какой-либо из связей, например отщепление фукозных остатков, связанных более лабильной гликозидной связью . [c.572]

При анализе структуры углеводных цепей гликопротеинов важным этапом является определение моносахаридного состава. Здесь используются обычные методы структурного анализа углеводов, а именно кислотный гидролиз или метанолиз с последующим хроматографическим разделением продуктов. По моносахаридному составу, как правило, можно судить и о типе углевод-белковых связей, в частности наличие N-aцeтилгaлaктoзaм>lнa говорит о присутствии О-гликозидных цепей. [c.475]

Ахрем А.А.,Аввакумов Г.В.,Свиридов О.В.,Стрельченок О.А.-Изв.АН БССР.Сер. хим.н.,1978,N0,98-105. Применение газо-жидкостной хроиатографии в структурных исследованиях углеводных компонентов гликопротеинов. I. Установление моносахаридного состава. Кислотный гидролиз и анализ сахаров в виде ацетатов полиолов. (Изучены различные способы кислотного гидролиза. НФ 0V-225 на газ-хроме Q. Нагрев программированный от 170 до 250°. Детектор пламенно-ионизационный.) [c.342]

Предлагая вниманию читателей данную методику, авторы полагают, что ГЖХ ацетатов альдитов будет использоваться для определения альдоз в таких биологических объектах, как олигосахариды, полисахариды и гликопротеины. После отработки условий гидролиза анализируемые образцы (1—5 мг) помещают в пробирки размером 13x100 мм, добавляют соответствующее количество кислоты и запаивают пробирки на горелке. Концентрация сахаров в смеси не должна превышать 0,5%, чтобы кислотная реверсия освобождающихся альдоз была сведена до минимума. [c.24]

Грэхем и сотр. [20] разработали другой, более удобный метод. По этому методу сиаловые кислоты, которые остаются связанными с гликопротеином после обработки нейраминидазой, удаляют кислотным гидролизом в очень мягких условиях. Из гликонротеина подчелюстной железы овцы после предварительного действия нейраминидазы и последующего мягкого кислотного гидролиза удаляется 98% сиаловых кислот. Однако даже в самых мягких условиях, достаточных для количественного удаления остаточных сиаловых кислот, из амидных групп образуется заметное количество аммиака, который необходимо определять отдельно. Содержание амидного азота в гликонротеине, освобожденном от сиаловых кислот, определяют, как описано для яичного альбумина (см. стр. 159 и далее). Ниже приведена подробная методика. [c.162]

Эти значения устойчивости чистых сахаров в горячих минеральных кислотах могут дать лишь весьма приближенное представление об их устойчивости в процессе гидролиза гликопротеинов, что объясняется несколькими причинами. Во-первых, происходит катализируемая кислотами реакция между свободными сахарами и такими аминокислотами, как триптофан, цистин, цистеин и метионин, ведущая к предпочтительному расщеплению этих аминокислот [8, 9] (см. также гл. 5). Однако имеется мало сведений о расщеплении в горячем кислом растворе сахаров в присутствии этих аминокислот известно, что цистеин повышает скорость деструкции маннозы [7, 10]. Некоторые поправки на исчезновение сахара можно ввести с помощью модельных экспериментов, в которых измеряют деструкцию, нагревая смеси, содержащие исследуемый сахар и аминокислоты, аналогичные тем, которые присутствуют в гидролизате изучаемого гликонротеина. Другим приемом является прибавление изотопно меченного сахара к гликопротеину перед гидролизом, выделение сахара или его производного и вычисление количества, присутствовавшего в гликопротеине, из данных изотопного разбавления [7]. Во-вторых, восстанавливающая группа моносахарида в условиях кислотного катализа может реагировать с первичной или даже со вторичными гидроксильными группами другой молекулы сахара, давая ди- или олигосахариды эта реакция называется кислотной реверсией [И, 12]. Такого рода бимолекулярные побочные реакции можно в значительной степени устранить, проводя гидролиз при низкой концентрации вещества. Однако таким способом нельзя избежать другого возмоншого источника ошибок. Сахар может предпочтительно освобождаться в виде переходного оксониевого или карбониевого иона, который, вероятно, будет легко взаимодействовать с реак- [c.196]

Гликозидные связи остальных моносахаридов, входящих в состав гликопротеинов (галактозы, маннозы и двух N-ацетилгексозаминов), обладают приблизительно одинаковой устойчивостью к кислотам, за исключением галактозидиой связи, которая несколько легче расщепляется, чем манно-зидпая (см. стр. 199). Конформационные и стерические факторы могут влиять иа устойчивость гликозидных связей этих сахаров, однако такое влияние с трудом поддается учету. Высокая устойчивость ацетамидной связи в N-ацетилгексозаминах (см. стр. 224) позволяет считать, что в обычно используемых условиях гидролиза дезацетилирование практически не имеет места (см. [39]). Однако, если такая реакция происходит, это вызывает резкое повышение устойчивости гликозидной связи соответствующего аминосахара к кислотному гидролизу (см. стр. 200). [c.263]

Углевод-пептидная связь через остаток аспарагина относительно устойчива и в кислотных и в щелочных условиях. К счастью, эта связь в гликопротеине, вероятно, более устойчива к кислотам (время полураспада 45 мин при 100° в 2 н. соляной кислоте), чем обычные гликозидные связи в гетеросахариде. Поэтому частичным гидролизом гетеросахарид-аминокислотного комплекса можно получить соединение, состоящее из аминокислоты и моносахарида, образующих углевод-пептидную связь. Очевидно, если такое вещество выделено, входящий в его состав моносахарид можно легко идентифицировать. В опытах авторов с яичным альбумином были получопы неоднозначные результаты, если частичный кислотный гидролиз осуществлялся на гликопептидах, содержащих несколько аминокислотных остатков. [c.279]

Определение обш его количества нейтральных сахаров в овомукоиде обработкой гликопротеина орцином или антроном в присутствии высококонцентрированной минеральной кислоты обычно дает приблизительно 8—10%. Однако при определении свободных гексоз в кислом гидролизате овомукоида получали значительно меньшую величину (например, 7% [37] 5,7% [38] 5,7% [21]). Очень маловероятно, что величины, полученные при применении орцина или антрона, при исследовании овальбумина являются завышенными. Если приведенная выше величина верна для овомукоида, расхождение может быть обусловлено потерей нейтрального сахара даже при сравнительно мягком кислотном гидролизе гликопротеина. Такая потеря может быть результатом разрушения выделенного сахара или, что более вероятно, захвата нейтральных сахаров дезацетилированпыми гексо-заминами ([38] см. также том 1, гл. 8). При работе с овомукоидом могут иметь место ошибки последнего типа, что объясняется сравнительно высоким отношением в его молекуле количества гексозаминов к гексозам (около [c.31]

Аминокислотный состав фетуина изучали в двух лабораториях, причем каждая группа исследователей использовала свой препарат (табл. 3). В обоих случаях был применен кислотный гидролиз гликопротеина и последующий анализ по методу Мура и сотр. [29]. Триптофан определяли спектрофотометрически. [c.62]

Дополнительное доказательство присутствия 2-ацетамидо-2-дезокси-в-глюкозы в ai-кислом гликопротеине плазмы человека было получено Джин-лозом и сотрудниками с помощью мягкого кислотного гидролиза. Из гидролизата выделили кристаллическую 2-ацетамидо-2-дезокси-4-0-( 3-в-галакто-пиранозил)-а-о-глюкопиранозу, которую идентифицировали несколькими методами с помощью получения кристаллического октаацетата [31], путем выделения метил-2-ацетамидо-2-дезокси-3,6-ди-0-метил-а-п-гликопиранозида из метилированного -кислого гликоиротеина [90], а также по выделению 2-ацетамидо-2-дезокси-в-глюкозы после обработки очищенной P-N-ацетил-глюкозаминидазой (КФ 3.2.1.30) [91]. [c.79]

Винцлер и сотр. [59, 107] изучали отщепление углеводных компонентов от -кислого гликопротеина плазмы человека при мягком кислотном гидролизе. Они обнаружили, что в 1 н. соляной кислоте при 100° через 15 мин отщепляются все остатки N-ацетилнейраминовой кислоты и фукозы. Гидролиз в течение 1 час необходим для отщепления 100% гексоз, но при этом остается еще 47% 2-амино-2-дезоксиглюкозы. Работая с очень разбавленными растворами кислоты, они показали, что N-ацетилнейраминовая кислота освобождается раньше фукозы, а галактоза раньше маннозы. Та же последовательность отщепления была найдена Капуто и Маркантом [104] для -кислого гликопротеипа из плазмы крысы и асцитной опухоли Иосида. [c.82]

Другой особенностью, которая отличает гликопротеины от остальных белков, является наличие в них углеводных остатков, которые мешают исследованию аминокислот, образующихся нри кислотном гидролизе. Эти вопросы обсуждаются в гл. 5 тома 1. Относительно трудно определять амидные группы в белках в присутствии гексозаминов, и особенно сиаловой кислоты этот вопрос обсуждается в гл. 6 тома 1. Взаимодействие между аминокислотами и восстанавливающими сахарами (см. том 1, гл. 4) приводит к частичному разрушению последних, создавая дополнительные трудности по сравнению с теми, которые встречаются при анализе высокоочищенных гетерополисахаридных комплексов. Однозначная идентификация углеводных компонентов при получении их кристаллических производных и другие соответствующие аспекты химии сахаров рассмотрены в гл. 7 тома 1. В гл. 8 обсуждаются различные условия при анализе углеводов гликопротеинов, обеспечивающие получение наиболее достоверных результатов. Методы, применяющиеся в настоящее время и включающие кислотный гидролиз с последующим определением моносахаридов, могут быть в дальнейшем усовершенствованы и улучшены. Необходимо, однако, признать, что для определения углеводных компонентов гликопротеинов необходимы новые методы. [c.294]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология