Гликопротеины, очистка

Определение структуры гликопротеинов требует (как и в случае других молекул) их предварительной очистки, которая может быть достигнута с помощью методов, обычно применяемых для белка. Для очистки некоторых гликопротеинов оказалось весьма плодотворным также применение аффинных колонок с лектинами (см. ниже). Углеводный состав гликопротеинов определяли после кислотного гидролиза при помощи газожидкостной хроматографии—масс-спектрометрии (ГЖХ—МС). Для изучения детальной структуры олигосахаридных цепей было опробовано множество различных методов. Наиболее эффективной оказалась комбинация ГЖХ—МС и ЯМР-спектрометрии с высоким разрешением. Особенности связей между сахарами в гликопротеинах (рассмотрение которых не входит в задачу данной главы) имеют фундаментальное значение для структуры и функций этих молекул. [c.300]

Индивидуальность полученных препаратов гликопротеинов контролируется чаще всего аналитическим ультрацентрифугированием (см., например, ), электрофорезом с подвижной границей или на носителях, хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе. Как и в случае полисахаридов, критерием однородности выделенного гликопротеина может служить неизменность его мономерного состава (моносахаридов и аминокислот) и физико-химических свойств при применении нескольких способов очистки. Для определения нативности выделенных веществ особое значение имеет контроль их биологической активности, в первую очередь иммунологических свойств. [c.567]

Общий тип построения гликопротеина. Известные до сих пор природные гликопротеины — высокомолекулярные соединения, молекулярный вес которых колеблется от нескольких тысяч до нескольких миллионов, причем иногда данные об одном и том же веществе, полученные в разных лабораториях, существенно отличаются из-за различия в методах выделения и очистки. [c.568]

Одним из классов дифильных блок-сополимеров, которые были синтезированы и исследованы в последнее время, являются блок-сополимеры с гидрофильным полисахаридным блоком и гидрофобным полипептидным блоком. В таких сополимерах полисахаридный блок является углеводной а- или р-фракцией, экстрагированной из овомукоида при ферментативной деградации полипептидной цели этого гликопротеина с последующими фракционированием на хроматографической колонке и очисткой. а-Фракция, имеющая молекулярный вес 1850, содержит один остаток сиаловой кислоты на конце, 3 остатка маннозы и 7 остатков Ы-ацетилглюкозамина [69]. р-Фракция, имеющая молекулярный вес 3200, состоит из одного остатка галактозы на конце, 5 остатков маннозы и 10 остатков Ы-ацетилглюкозамина [69]. Эти два олигосахарида оканчиваются остатком аспарагина, что позволяет синтезировать блок-сополимеры с гидрофобным полипептидным блоком как вторым блоком сополимера [70]. [c.248]

Работа с высокополимерными углеводами, содержащими часто сравнительно небольшое число компонентов, создающих довольно монотонные структуры при малом числе сильно поляризованных групп и высокой лабильности, создает особые дополнительные трудности (как в отношении очистки, так и в изучении строения), с которыми не приходится встречаться при изучении других биополимеров. В еще большей степени это относится к углеводсодержащим биополимерам (гликопротеинам и др.), в отношении которых нужно иметь представление об углеводной и неуглеводной части и связывающих их звеньях. [c.4]

В экспериментах по рассеянию света всегда необходима особая тщательность и внимание при удалении всех рассеивающих примесей как из вещества, так и из растворителя. Практически это особенно важно для веществ с очень высоким молекулярным весом, если надо определить рассеяние света под малыми углами. Обычно перед измерением рассеяния света растворитель и раствор подвергают центрифугированию при высокой скорости в большинстве случаев такой обработки вполне достаточно. Более высокая степень очистки достигается созданием эмульсии между раствори-те.тем и смесью амиловый спирт — хлороформ перед центрифугированием [251], а ес.ти гликонротеин выдерживает такую обработку (некоторые гликопротеины ее выдерживают), то та же операция может быть применена и к раствору. Многие гликонротеины, в частности находящиеся в слизистых выделениях, действуют как защитные коллоиды, препятствующие коагуляции и осаждению лиофобных золей. Так, например, осадок сульфата бария, [c.86]

Окончательную очистку малых количеств -кислого гликопротеина проводили с помощью зонального электрофореза на различных носителях (бумага [41], крахмальный гель [42], и поливинилхлорид [32]). Маршалл и Порат [43] недавно описали прямое фракционирование больших количеств сыворотки на целлюлозном порошке. Этот же метод был использован авторами для очистки (-кислого гликопротеина, выделенного осаждением сульфатом аммония или хлорной кислотой. [c.72]

ОПРЕДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ ГЛИКОПРОТЕИНОВ [c.300]

ТИПОВ основано на использовании их различной аффинности по концевым углеводным остаткам, характеристичным для отдельных гликопротеинов. При разработке подходящего метода очистки данных гликопротеинов или гликопептидов с помощью лектинов Кристиансен [20] рекомендует следующие этапы [c.120]

Важнейшие источники Л.-семена растений, особенно бобовых (в последних их содержится 2-10% от общего кол-ва белков). Для выявления Л., как правило, используют р-цию агглютинации интактных или модифицир. эритроцитов. Очистку Л. осуществляют так же, как и др. белков, в т. ч. с помощью аффинной хроматографии, используя в качестве сорбентов полисахариды, гликопротеины и синтетич. углеводы, иммобилизованные на носителе. [c.586]

Л. применяют для аффинной очистки гликопротеинов и гликолипидов, при исследовании структуры углеводных цепей, для изучения распределения и структуры углеводных детерминант пов-сти клеточных мембран, для стимуляции лимфоцитов (коиканавалином А, фитогемагглютинином фасоли и нек-рыми др. Л.), а также для диагностики групп крови и выявления групповых детерминант в гликопротеинах биол жидкостей. [c.586]

Совершенствование аффинной хроматографии также позволило использовать очень специфическую технику очистки. Китаму-ра и др. [59] очищали И S-глобулин сои, пропуская экстракт через колонку сефароза — конканавалин А. Глобулин 7S, который представляет собой гликопротеин, удерживается в геле, тогда как И S-глобулин элюируется. Кэйзи [17] изолировал легумин гороха иммунной аффинной хроматографией на колонке сефарозы, в которую введен IgG-антилегумин. По свидетельству этого автора, данный метод можно применить ко всему набору сортов гороха, несмотря на некоторую генетическую изменчивость состава легумина. [c.155]

В качестве последнего примера белков, связывающих малые молекулы, уместно рассмотреть лектины. Эти белки, чаще всего встречающиеся в растениях (но не только в них), связывают производные углеводов со значительной степенью стереоспецифичности. Впервые лектины привлекли внимание исследователей своей способностью агглютинировать эритроциты посредством связывания гликопротеинов мембран. Некоторые лектины специфичны к индивидуальным групповым веществам крови. Интерес к ним увеличился после того, как было обнаружено, что некоторые из лек-тинов агглютинируют преимущественно злокачественные клетки. Посредством иммобилизации на нерастворимом носителе типа агарозы лектины могут быть использованы для очистки гликопротеинов методом афинной хроматографии. Наиболее изученным лек-тином является конкавалин А для этого белка определены аминокислотная последовательность из 238 остатков и трехмерная структура. Конформация конкавалина А весьма примечательна. Семь участков его единственной полипептидной цепи формируют антипараллельную складчатую структуру, а шесть последующих участков образуют другую антипараллельную структуру, перпендикулярную первой. Ион Mn + координирован с двумя молекулами воды и боковыми радикалами Н18-24, 01и-8, Азр-Ш и Азр-14, образуя октаэдр. Ион Са +, расположенный на расстоянии 0,5 нм от Мп +, делит с ним два последних лиганда, а также связан с карбонильным кислородом Туг-12, боковым радикалом Айп-14 и двумя молекулами воды и также образует октаэдрическую конфигурацию. Остатки глюкозы и маннозы связываются в глубоком кармане размером 0,6 X 0,75 X 1,8 нм, образованным, как это ни удивительно, гидрофобными остатками. [c.562]

Эта группа гликопротеинов включает фолликулостимулирующий Гормон, лютеинизирующий гормон, хорионический и менопаузальный гонадотропины человека, гонадотропин сыворотки жеребых кобыл и тироидстимулирующий гормон. Первичная структура углеводных фрагментов этих гликопротеинов еще не определена нз-за сложности отделения достаточного количества чистого гормона от очень похожих (по химическим и физическим свойствам) гормонов и других макромолекул, включая гликопротеины, присутствующие в окружающей среде. Методам исследования гормонов посвящен обзор [190]. Очистка отдельного гормона включает ряд Стадий, причем успех этой операции зависит от специфических свойств молекулы гормона наличия кислотных или основных групп Р некоторых аминокислотных остатках и кислотных групп 5-ацет- [c.265]

Использование радиолигандного метода позволило приступить к выделению и очистке рецепторов гормонов из мембран. В настоящее время многие рецепторы получены в достаточно гомогенной форме, определены их коэффициент седиментации, молекулярная масса, радиус Стокса, степень гидрофобности и т. д. Рецепторы нескольких гормонов выделены в высокоочищенном виде. Удалось показать, что в большинстве случаев гормональные рецепторы — это гликопротеины. [c.239]

Широкое применение для очистки растворимых и мембранных гликопротеинов находит аффинная хроматография на иммобилизованных. пектинах, таких как конкаиавалии А, агглютинины зародышей пшеницы и бобов клещевины, лектин чечевицы. [c.471]

В ряду с осмотическими процессами находится диализ, когда происходит непрерывная диффузия малых молекул в циркулирующий растворитель с удерживанием больших молекул. При этом отсутствует выраженный перенос растворителя против градиента концентрации. Диализ применяют, например, при очистке антигенных препаратов, представляющих собой протеины, гликопротеины или более сложные комплексы. С помощью диализа через раличные мембраны освобождаются от неорганических солей. [c.391]

Поскольку н Т-, н В-лимфоциты встречаются во всех периферических лимфоидных тканях, нужно было найти удобные методы, которые позволяли бы различать н разделять эти два типа клеток,-только после этого можно было изучать их индивидуальные свойства. К счастью, различительными маркерами могут служить многочисленные белки плазматической мембраны, характерные только для Т- нли только для В-клеток. Один нз наиболее часто используемых шркеров-гликопротеин Thy-], который у мышей имеется на Т-, но не на В-лимфоцитах поэтому антитела к Thy-1 можно использовать для удаления нли очистки Т-клеток из смешанной популящ1н лимфоцитов мыши. Использование антигенных маркеров клеточной поверхности для различения и разделения Т- и В-клеток революционизировало клеточную иммунологию и сыграло важную роль в быстром прогрессе этой области знания в последние годы. У экспериментальных животных и у человека находят все больше и больше новых маркеров, характерных для функционально различных субпопуляций Т- и В-лимфоцитов. [c.11]

Демонстрация ключевой роли сиаловой кислоты как компонента многих гликонротеинов в их отношении к частице вируса гриппа и к вирусной инфекции (обзор см. [186]) имела большое влияние на современные исследования гликонротеинов. Можно отметить лишь немногие направления в современном развитии исследований. Многие уже известные и очищенные гликонротеины, включая групповые вещества крови и белки сыворотки, были исследованы вновь и вскоре стала очевидной широкая распространенность гликонротеинов, содержащих сиаловые кислоты. Присутствие сиаловой кислоты во многих гликопротеинах, представляющих биологический интерес, делает необходимым развитие мягких методов их выделения и очистки, поскольку кетозидная связь, соединяющая концевой остаток сиаловой кислоты с ее партнером, чувствительна даже к 0,05 п. минеральной кислоте. Ферментативное отщепление сиаловой кислоты от гликонротеинов позволило оценить ее вклад в физические, химические и биологические свойства индивидуальных гликопротеинов. Этот подход был очень плодотворным. Так, оказалось, что сиаловая кислота ответственна за низкую изоэлектрическую точку и высокую электрофоретическую подвин ность сиалогликопротеинов, за электрофоретическую подвижность эритроцитов и раковых клеток, за вязкость гликонротеинов слюны, за биологическую активность гонадотропинов и других гормонов и за правильное функционирование фактора Кэстла. По счастливому стечению обстоятельств этот рост исследований гликонротеинов происходил в то время, когда был доступен арсенал чувствительных, мощных и специфических методов исследования состава и структуры сложных белков и определения их физических свойств и химической реакционной способности. Ниже будут рассмотрены успехи, достигнутые к настоящему времени. [c.23]

Как правило, уже иа стадии выделения и очистки гликопротеина и определения его гомогенности исследователь, наблюдая поведение вещества в ходе соответствующих операций, может составить некоторое представление о молекулярном весе гликонротеина и нолучить самые предварительные сведения о форме его молекул. Так, например, обычно становится известным, являются ли растворы гликонротеина высоковязкими или нет, а также зависит ли в заметной степени их вязкость от ионной силы. Как правило, становится ясным, способен ли данный гликопротеин к денатурации, а также выясняется его поведение нри гель-фильтрации на колонках. Определение содержания в препарате сиаловой кислоты и сульфатных групп показывает, насколько сильно заряжены его молекулы. После выяснения этого вопроса необходимо решить, достаточно ли велик этот заряд, чтобы возникала необходимость в применении специальной обработки. Вообще [c.95]

В этой главе описываются методы определения последовательности моносахаридных остатков и типов связей, которыми они соединяются друг с другом. Вопрос о характере связи гетеросахаридов с пептидными цепями здесь не рассматривается, поскольку ого подробному изложению посвящена гл. 10. По современным представлениям углеводные компоненты гликопротеинов состоят из одной или нескольких углеводных цепей, каждая из которых содержит относительно небольшое число (2—15) моносахаридных остатков, из которых но крайней мере один является остатком 2-аминогексозы. В большинстве случаев в гликопротеинах встречаются разветвленные углеводные цепи. Обычно гликопротеины доступны лишь в относительно малых количествах, причем для получения интерпретируемых результатов структурного исследования часто необходима тщательная очистка вещества, поэтому методы установления строения должны быть пригодны для малых количеств исследуемого полимера. [c.239]

В последнем десятилетии XIX века было обнаружено, что в крови имеются вещества, содержащие углеводный остаток, химически связанный с белком. Первые попытки исследования химической структуры этих веществ связаны с именами Бьерри, Хьюитта, Римингтона и др. После второй мировой войны интерес к изучению этой проблемы резко возрос. Это было обусловлено в основном успехами в разработке методов фракционирования и идентификации белков. Усовершенствование методов очистки белков заставило химиков многократно повторять уже проведенные опыты со все более и более чистыми препаратами. Некоторые гликопротеины, исследованные в период 1920—1940 гг., например серомукоид, имели степень очистки, по современным представлениям составляющую 60—70%. Однако многие соединения, которые рассматривались в то время как одно или два вещества, впоследствии были разделены на большое число хорошо изученных гликопротеинов. Вещество, описываемое в этой главе, — а -кислый гликопротеин плазмы человека, рассматривается нами как индивидуальный белок. Однако недавно были получены сообщения о возможности дальнейшего разделения его на несколько компонентов, причем нельзя с уверенностью сказать, что каждый из этих компонентов является гомогенным по химической структуре. Следовательно, изучение физических и химических свойств вещества, которое доступно нам в настоящее время, дает возможность получить представление только о некоторой модельной молекуле с усредненной структурой. [c.67]

При фракционировании серомукоида сначала сульфосалициловой кислотой, а затем этанолом был получен продукт, содержащий 10,4% азота, 18,8% гексоз (в пересчете на глюкозу) и 10,6% глюкозамина. При этом впервые было отмечено, что гликопротеин имеет изоэлектрическую точку при значениях pH 3,4. После дальнейшей очистки пикриновой кислотой были получены фракции с более высоким содержанием гексоз, однако возможно, что при этом происходило некоторое разрушение гликопротеина [17]. [c.69]

Недавно проведенные исследования Шмида и сотр. [44—48] показали, что препарат -кислого гликопротеина, гомогенный при свободном электрофорезе после очистки на ионообменной смоле, разделяется на семь компонентов при электрофорезе на крахмале по Смитису [49]. После удаления сиаловых кислот были получены три основные зоны. Эти опыты хорошо воспроизводимы, и их можно повторить на препаратах, полученных разными методами. До настоящего времени не удалось обнаружить каких-либо различий в соотношениях аминокислотных и углеводных компонентов во всех полученных фракциях (за исключением одного компонента, содержащего немного меньше тирозина и триптофана), и все фракции одинаково реагировали с иммунной сывороткой козы. [c.72]

Как уже обсуждалось во вступительной части, значительное число работ по изучению химической структуры -кислого гликопротеипа проводилось на препаратах, которые не обладали такой степенью очистки, которой добиваются в настояш,ее время, выделяя веш ества, называемые -кислый гликопротеин и орозомукоид . Это особенно касается изучения их углеводных компонентов. Некоторые углеводные компоненты чистого -кислого гликопротеипа никогда не были выделены из очищенного препарата и охарактеризованы химическим путем. До сих пор остаются некоторые сомнения относительно их строения и оптической изомерии. [c.77]

Независимо были проведены сходные опыты с очищенной нейраминидазой из Z). pneumoniae и при этом были получены такие же результаты [ 63, 1111. Как оказалось, фермент обладал низкой специфичностью, поскольку при реакции выделялась также N,0-диaцeтилнeйpaминoвaя кислота [631. В связи с этим описанные опыты не могли разрешить вопрос о гомогенности остатков сиаловых кислот. Недавно была проведена очистка больших количеств нейраминидазы из D. pneumoniae и изучено ее действие на -кислый гликопротеин [821. Скорость отщепления N-ацетилнейраминовой кислоты остается постоянной до тех пор, пока не отщепится 90% остатков, а при продолжительной инкубации можно получить 100%-нов отщепление. Оптимум действия фермента находится при pH 6,5, константа Михаэлиса равна 3,5 -10 М для проявления активности фермента не требуется присутствие ионов металлов. [c.84]

Ицуми и сотр. [139] инкубировали -кислый гликопротеин плазмы человека с очищенной протеазой, выделенной из ЗШрЮтусез дпзеиз (прона ЗОЙ). Полученные продукты фракционировали этанолом и разделяли хроматографически на ионообменной смоле. После трех обработок ферментом общий выход продуктов составлял 40%, и при окончательной очистке на на ДЭАЭ-целлюлозе получена одна фракция в виде хорошо отделяющегося [c.92]

Недавно Бурильон и сотр. [146] использовали метод расщепления, примененный ими ранее для изучения нативного -кислого гликоиротеина (см. выше, [25]), для исследования -кислого гликопротеина, из которого удалена сиаловая кислота. Единственное изменение, введенное ими, состояло в том, что на последней стадии очистки они заменили ионообменную смолу сефадексом-25. После обработки смеси гликопентидов проназой были выделены свободные аминокислоты и пептиды, которые были подвергнуты очистке на сефадексе-25. Фракцию, содержащую углеводы, разделяли с помощью электрофореза на бумаге при pH 6,4 на три компонента. Первый компонент содержал аспарагиновую кислоту, треонин и лизин, второй компонент — аспарагиновую кислоту, треонин, пролин, тирозин и лейцин или (после продолжительной обработки проназой) только аспарагиновую кислоту, треонин и пролин. Третий компонент содержал глутаминовую и аспарагиновую кис- [c.94]

Так называемый муциновый сгусток представляет собой муцин , впервые описанный Хаммарстеном [1]. Он осаждается из экстрактов железы при добавлении кислоты до pH 3,5. Муциновый сгусток растворяется в воде и диссоциирует при подщелачивании до pH 6 на ряд компонентов, среди которых имеется белок (катион) и кислый гликопротеин (анион). Сгусток содержит около 70% белка и углеводные остатки, характерные для очищенного гпикопротеина, описанного ниже [25]. Большая часть белка способна диссоциировать, причем последующие стадии очистки приводят к удалению свободного белка. Очищенный ПЖБ-П не образует муцинового сгустка без добавления сывороточного альбумина или аналогичного белка. [c.144]

Муциновый сгусток можно очистить из его растворов путем фракционной преципитации смесью этанол — вода — хлористый кальций [25]. Дополнительная очистка достигается с помощью депротеинизации по методу Севага. Однако при этом ПЖБ-П может частично деполимеризоваться и становиться не полностью гомогенным. Полученные препараты ПЖБ-П (см. ниже) содержали от 32 до 37% белка и имели примерно такой же углеводный состав, что и препараты гликопротеина, описанные ниже. [c.144]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология